豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白抗原表位區(qū)的表達(dá)及其免疫原性分析

秦志華，張明宇，張傳美，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109）

豬傳染性胃腸炎(TGE)是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以嘔吐、嚴(yán)重水樣腹瀉、脫水為特征。目前，世界上大多數(shù)國(guó)家免疫接種弱毒疫苗防治TGE，然而這些常規(guī)疫苗免疫存在成本高、易返祖、有潛在感染危險(xiǎn)等缺陷[1]。因此，現(xiàn)在許多國(guó)家都在致力于基因工程疫苗的研究。

豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白突出于病毒粒子外，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，起到免疫保護(hù)作用[2]。S蛋白上含有A、B、C、D四個(gè)主要的抗原位點(diǎn)，所構(gòu)成的抗原表位區(qū)產(chǎn)生的保護(hù)作用相當(dāng)于整個(gè)S蛋白[3]。本文正是對(duì)S蛋白的抗原表位區(qū)進(jìn)行免疫原性分析，為今后TGEV亞單位疫苗的研制和免疫保護(hù)性候選基因的篩選提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及試驗(yàn)動(dòng)物 His-Bind蛋白純化回收試劑盒，購(gòu)自Novagen公司；BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶，rTaq酶，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；弗式佐劑，購(gòu)自Sigma公司；體重約18 g，4～6周齡的SPF級(jí)昆明系小鼠，購(gòu)自青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社。

1.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-S的構(gòu)建 根據(jù)GenBank收錄的S基因序列（登錄號(hào)：EU074218.2），利用Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1：5′-CGGGATCCGGTAACCATTGGAATCTCA-3′，P2：5′-GCGAAGCTTGCAGGAATCTAGGTGTAGC-3′（分別加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)）。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 971 bp，包括S基因的抗原表位區(qū)。BamHⅠ和HindⅢ雙酶切連接到pET30a質(zhì)粒，鑒定后的陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序分析。

1.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將含重組質(zhì)粒的菌液按1∶100比例重新接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)OD600=0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白表達(dá)情況。

1.4 Western-blot分析 將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)半干式電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)膜后，5%BSA封閉PVDF膜過夜，使用抗His標(biāo)簽兔多克隆抗體作一抗，羊抗兔IgG（HRP）作二抗孵育后進(jìn)行ECL化學(xué)曝光。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物分組及血清抗體水平的檢測(cè) 將小鼠隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組12只，其中試驗(yàn)組小鼠背部皮下注射純化回收后的TGEV S蛋白，對(duì)照組注射生理鹽水。初次免疫后每隔14 d加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次。初免時(shí)蛋白免疫劑量為50 μg/只，加強(qiáng)免疫時(shí)蛋白免疫劑量為100 μg/只。分別于首免后第0天，14天，28天，42天采血，抗原包被濃度為2.5 μg/mL，血清抗體稀釋度為1∶200時(shí)，間接ELISA檢測(cè)免疫后小鼠的抗體水平。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的擴(kuò)增，克隆和鑒定 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見約1 971 bp的片段，與預(yù)期目的片段大小相符（見圖1）。測(cè)序結(jié)果證明，已成功構(gòu)建pET30a-S重組表達(dá)載體。

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 結(jié)果如圖2顯示，有80.4 Ku的與預(yù)期大小相符的目的蛋白條帶，而在pET 30a空載體中則沒有出現(xiàn)相應(yīng)條帶，說明該蛋白條帶是由載體中目的基因所表達(dá)的。

2.3 Western-blot分析 經(jīng)Western-blot鑒定，將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜經(jīng)一抗二抗孵育，ECL曝光后可見明顯的特異性反應(yīng)帶（見圖3），說明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。

2.4 抗TGEV血清IgG抗體間接ELISA檢測(cè) 從圖4中可以看出，小鼠在免疫接種前均為TGEV抗體陰性。首免后第14天，試驗(yàn)組小鼠檢測(cè)到抗體陽性，說明小鼠在免疫后產(chǎn)生了TGEV特異性抗體，隨著免疫次數(shù)的增加，試驗(yàn)組抗體水平上升明顯。在整個(gè)免疫過程中，對(duì)照組未檢測(cè)到TGEV特異性抗體。

3 討論

纖突（S）蛋白存在抗原位點(diǎn)、抗原亞位點(diǎn)和抗原決定簇3種水平的抗原結(jié)構(gòu)，抗原分A、B、C、D四個(gè)位點(diǎn)，這些位點(diǎn)又可分為抗原決定簇，S蛋白共有11個(gè)抗原決定簇，其中5個(gè)是與中和作用相關(guān)的重要抗原決定簇[4]。S蛋白是惟一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白，所以S蛋白是基因工程研究的重中之重，尤其近年來國(guó)內(nèi)外研究者在S蛋白的表達(dá)方面進(jìn)行了不斷的探索[6]。考慮到后期疫苗制備過程中的成本和效率問題，本研究初步選定使用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)，由于S基因編碼序列全長(zhǎng)為4.35 kb，若對(duì)S基因全基因進(jìn)行克隆，可能會(huì)在蛋白表達(dá)過程中遇到困難，研究表明，A、B、C、D四個(gè)抗原位點(diǎn)誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)作用相當(dāng)于整個(gè)S蛋白，因此本試驗(yàn)結(jié)合前者的研究，基于S基因4個(gè)位點(diǎn)組成的抗原表位區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出1 971 bp的目的片段，動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白的免疫原性以驗(yàn)證其是否適合作為基因工程疫苗的潛在基因應(yīng)用。

現(xiàn)已知TGEV的N蛋白在誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著重要作用[6]，在接下來的研究中可以設(shè)想將S蛋白和N蛋白共同表達(dá)。楊恒等[7]研究結(jié)果顯示，S、N蛋白融合表達(dá)誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫水平低于S蛋白單獨(dú)表達(dá)，這可能是因?yàn)閮蓚€(gè)蛋白融合表達(dá)造成蛋白構(gòu)象改變導(dǎo)致的，在進(jìn)一步的研究中筆者認(rèn)為可以嘗試在S、N基因間插入一段接頭序列(Linker)或構(gòu)建雙啟動(dòng)子表達(dá)載體。

本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，以豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白A、B、C、D四個(gè)抗原位點(diǎn)所表達(dá)的蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，且有一定的效果，初步預(yù)示了其作為基因工程疫苗候選基因的可行性，這為豬傳染性胃腸炎的防治提供了一個(gè)安全有效的途徑，并為以后研究應(yīng)用提供了可靠的保障和堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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