乙型肝炎病毒基因分型的臨床意義及基因分型方法

彭銳綜述，張洪審校（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060）

我國(guó)是乙型肝炎病毒（HBV）感染的大國(guó)，據(jù)研究表明全球有3.5億HBV 攜帶者，我國(guó)占三分之一，每年發(fā)病率達(dá)6000萬(wàn)人次以上。不同HBV DNA 基因型之間存在著致病性的差異，因此，HBV 基因分型對(duì)快速了解患者感染病毒狀況具有十分重要的作用。HBV 屬于嗜肝DNA 病毒科，部分雙鏈環(huán)形DNA 病毒，基因組長(zhǎng)約3.2kb，基因組中包含4個(gè)開(kāi)放區(qū)：前S／S、前C／C、X和P區(qū)［1］。由于缺乏校對(duì)功能的酶，HBVDNA復(fù)制過(guò)程容易發(fā)生堿基錯(cuò)配，從而發(fā)生基因突變形成不同基因型。

1 HBV 基因多態(tài)性

1.1 地域分布目前根據(jù)全基因序列異質(zhì)性大于或等于8%，將HBV 基因型分為A～J 10種不同類(lèi)型，并且每種基因型分布存在地域差異現(xiàn)象［2］?；蛐虯 包含A1～A7七種亞型；B型有B1～B9九種亞型；基因型C有12種亞型C1～C12；D型有8種亞型D1～D8；基因型F 只有4種亞型F1～F4；其他基因型目前還未發(fā)現(xiàn)亞型存在。有關(guān)HBV 基因型研究表明，B和C 基因型主要分布在亞洲；而歐洲最常見(jiàn)的基因型是A 和D型［3］。雷延昌等［4］研究湖北省190例HBV DNA 陽(yáng)性血清標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，B基因型140例（73.7%），C 基因型42例（22.1%），BC混合型8例（4.2%），未發(fā)現(xiàn)A、D 和E 基因型；新疆地區(qū)B型占5.56%，C 基因型也占據(jù)5.56%，BC 雜合型有22.22%，而D 基因型高達(dá)66.67%。說(shuō)明HBV 基因型在我國(guó)的地域分布存在明顯差異，見(jiàn)表1。

1.2 HBV 基因型與肝病演化的關(guān)系研究表明基因B型通常引發(fā)輕微肝纖維化；C型易引起侵害性的嚴(yán)重肝臟疾病，可發(fā)展為肝硬化和肝癌；A 基因型攜帶者比D 基因型更易發(fā)展為慢性肝炎，D 基因容易誘導(dǎo)急性肝炎［5］。因此，臨床治療前HBV DNA 基因型檢測(cè)具有十分重要的作用，對(duì)臨床抗病毒治療方法的選擇、預(yù)后判斷都有指導(dǎo)意義。

1.3 慢性乙型肝炎（CHB）CHB表現(xiàn)出明顯的地域分布多態(tài)性，在亞洲和非洲發(fā)病概率較高，而在北美和歐洲發(fā)病概率相對(duì)較低。目前，世界上超過(guò)3.5億人是HBV 慢性感染者，60%肝癌患者通過(guò)CHB 演化而來(lái)。CHB 感染者乙型肝炎表面抗原（HBsAg）比健康個(gè)體含量高1.5%。HBV 存在多種傳播途徑，包括輸血、子宮內(nèi)、性關(guān)系、家族之間和醫(yī)院內(nèi)傳播等［6］。HBV 感染后的臨床治療結(jié)果高度可變，遺傳和環(huán)境因素對(duì)肝臟疾病的進(jìn)展起著重要的調(diào)節(jié)作用。人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量闡述了感染者的年齡、性別、生活習(xí)慣、伴隨疾?。ㄈ缏跃凭膊　⑵渌尾《靖腥镜龋┒紩?huì)影響HBV持續(xù)性感染［7－9］。CHB會(huì)發(fā)展為其他肝臟疾病，像肝纖維化、肝硬化和肝癌等，緊密依賴(lài)于與疾病相關(guān)基因型。

表1 中國(guó)部分省份HBV 基因型分布差異

1.4 HBV 基因型對(duì)藥物使用的影響 HBV 基因突變會(huì)產(chǎn)生病毒耐藥現(xiàn)象，比如：拉米呋定是抗HBV 治療的一線藥物，耐藥的主要機(jī)制是HBV－DNA 聚合酶基因突變引發(fā)病毒DNA與藥物的結(jié)合力減弱，主要是rtL180M＋rtM204V 和rtM204I突變。另外一個(gè)研究說(shuō)明，阿德福韋耐藥菌株的位點(diǎn)是rtN236Tand rtA181［10］。HBV 基因C型患者比B型基因突變更易產(chǎn)生耐藥性，但是其機(jī)制并沒(méi)有完全闡明?？赡苁怯捎诓煌琀BV 基因型結(jié)構(gòu)差異編碼出不同蛋白質(zhì)，以至于對(duì)拉米呋定產(chǎn)生了不同耐藥反應(yīng)。另一原因也許是在服用拉米呋定后，基因C型相對(duì)基因D型更容易出現(xiàn)YMDD 突變［11］。所以更應(yīng)注意對(duì)基因C型乙型肝炎患者的關(guān)注，無(wú)論在抗病毒治療過(guò)程還是對(duì)常見(jiàn)耐藥位點(diǎn)的監(jiān)測(cè)。對(duì)長(zhǎng)期服用核苷酸類(lèi)似藥物的患者，對(duì)耐藥突變和基因檢測(cè)顯得尤為重要，有助于了解不同基因型乙型肝炎患者相關(guān)耐藥基因，幫助選擇抗病毒藥物、對(duì)個(gè)體化抗病毒治療提供科學(xué)依據(jù)［12］。HBV 基因型差異對(duì)干擾素的反應(yīng)也存在區(qū)別，干擾素對(duì)基因B型和C型的患者治療效果更好；基因D型比混合基因型有更好的治療效果。主要是因?yàn)镠BV 基因C 區(qū)啟動(dòng)子C 遺傳變異的分子特征決定。攜帶基因A型患者對(duì)干擾素治療效果較好，因?yàn)镠BV 基因C區(qū)容易發(fā)生啟動(dòng)子突變和更少核衣殼蛋白變異。而且前C區(qū)終止密碼子突變會(huì)導(dǎo)致干擾素療效的下降。

2 HBV－DNA 基因型檢測(cè)

HBV 耐藥基因突變和基因型檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有潛在價(jià)值，尋找一種適合臨床檢測(cè)的方法非常必要。研究表明，近年來(lái)許多方法用于檢測(cè)HBV 耐藥基因和進(jìn)行基因分型。比如基于測(cè)序的方法［克隆測(cè)序和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物直接測(cè)序］；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）［13－14］；PCR 特異性引物測(cè)序；基于雜交的方法［寡核苷酸芯片、INNO－LiPA 分型和PCR 微型板塊雜交－酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)］等。

2.1 PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序方法此方法主要包括HBV－DNA全基因測(cè)序和S基因測(cè)序，直接測(cè)序方法是目前臨床上最常見(jiàn)的檢測(cè)方法，通過(guò)測(cè)序來(lái)檢測(cè)病毒基因型和直觀的變異，是HBV 基因型檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在許多缺陷，如操作繁瑣、耗時(shí)、高成本和較難改進(jìn)等，而且只能檢測(cè)出突變大于或等于20%的基因型。有關(guān)研究說(shuō)明，S基因測(cè)序與全基因測(cè)序有著同樣的準(zhǔn)確性，HBV－NA S基因區(qū)由S基因、前S1基因和前S2基因組成，它們能夠分別編碼HBsAg的小蛋白、大蛋白和中間蛋白。但是S基因測(cè)序也是種昂貴、耗勞動(dòng)力的方法，不適合大范圍臨床和流行病學(xué)研究工作。

2.2 PCR－RFLP 此方法是結(jié)合PCR 技術(shù)和RFLP技術(shù)，使來(lái)源于PCR 擴(kuò)增的目的片段在合適的限制性?xún)?nèi)切酶水解作用后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，不同的基因型片段呈現(xiàn)出不同長(zhǎng)度的條帶［15］，從而加以區(qū)分，是臨床上一種有效的檢測(cè)方法。

2.3 INNO－LiPA 分型和寡核苷酸芯片法

2.3.1 INNO－LiPA 分型作用原理為生物素標(biāo)記的HBVDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與以平行方式固定在尼龍膜上的寡核苷酸探針雜交，未雜交的DNA 被沖洗掉；然后，加入的堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉菌親和素與生物素標(biāo)記的雜交產(chǎn)物結(jié)合；最后，將BCIP／NBT 加入到尼龍膜上觀察顏色的變化。

2.3.2 寡核苷酸芯片法此法是基于反相雜交的原理，使Cy5標(biāo)記的擴(kuò)增子與固定在微板上的特異性類(lèi)型寡核苷酸雜交。

2.4 PCR 微型板塊雜交－ELISA技術(shù)PCR提取血清樣品中HBV－DNA，然后與兩個(gè)特異性探針雜交。其中一個(gè)探針用于捕獲HBV－DNA，另一種是5′端生物素標(biāo)記的基因分型探針。此技術(shù)靈敏性和特異性和S基因直接測(cè)序法相同，可適用于大范圍的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)研究。

2.5 微陣列它是基于雜交的一種方法，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。但是其靈敏性并不高，因此相關(guān)研究通過(guò)增強(qiáng)信號(hào)的方法解決此問(wèn)題。采用兩種信號(hào)增強(qiáng)的辦法來(lái)增加微陣列DNA的熒光信號(hào)強(qiáng)度，即多標(biāo)記側(cè)鏈引物和多檢測(cè)點(diǎn)引物。前種方法是同時(shí)增加特異性擴(kuò)增的靶標(biāo)產(chǎn)物熒光標(biāo)記分子的數(shù)量；后者是增加每個(gè)雜交位置可檢測(cè)的熒光分子。

2.6 HiSeq測(cè)序上述方法在操作過(guò)程都存在各種缺陷，因此Han等［16］改進(jìn)成新技術(shù)HiSeq測(cè)序。此測(cè)序首先將經(jīng)過(guò)剪切的DNA 片段兩端加上接頭并通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合固定在芯片表面，使用引物擴(kuò)增后將雙鏈變性為單鏈后該單鏈的一端就固定在芯片上，另一游離端可隨機(jī)與附近另外一個(gè)引物互補(bǔ)結(jié)合，也被固定形成一個(gè)橋。用引物PCR 后每個(gè)DNA 片段大約獲得1000倍擴(kuò)增，形成單克隆的DNA 簇群。HiSeq測(cè)序?qū)BV 基因型的檢測(cè)有較高的靈敏性、精確性、高通量和自動(dòng)化，是檢測(cè)HBV DNA 基因突變和分型的好方法。橋式PCR的設(shè)計(jì)采用一個(gè)引物連接標(biāo)記序列的末端。在PCR 循環(huán)反應(yīng)中，橋式引物將標(biāo)記片段串聯(lián)起來(lái)，是一種能高通量的將標(biāo)記序列進(jìn)行簡(jiǎn)單、有效的擴(kuò)增。

3 結(jié)論

HBV 基因型呈現(xiàn)出明顯的域分布差異，研究不同基因型間的不同致病性對(duì)疾病演進(jìn)、傳播方法和抗病毒的治療有著重要的意義。即使現(xiàn)在HBV－DNA 檢測(cè)技術(shù)和分型方法得到了改進(jìn)，但是一種更適合大樣本基因型分析和低成本、低耗時(shí)的方法還有待探索。希望通過(guò)不斷探索，將這些成果運(yùn)用到HBV 預(yù)防、治療和乙型肝炎患者臨床類(lèi)型檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)真正的個(gè)體化用藥。

［1］Ganem D，Prince AM.Hepatitis B virus infection－－natural history and clinical Consequences［J］.N Engl J Med，2004，350（11）：1118－1129.

［2］Kao JH.Molecular epidemiology of hepatitis B virus［J］.J Gastroenterol Hepatol，2012，27（5）：7－8.

［3］Lazarevic I，Cupic M，Delic D，et al.Distribution of HBV genotypes，subgenotypes and HBsAg subtypes among chronically infected patients in Serbia［J］.Arch Virol，2007，152（11）：2017－2025.

［4］雷延昌，郝友華，田擁軍，等.湖北地區(qū)乙型肝炎病毒基因型分布與臨床的相關(guān)性［J］.中華肝臟病雜志，2005，13（2）：35－38.

［5］World Health Organization.Hepatitis B vaccines［J］.Reactions Weekly，2009，126（31）：20－23.

［6］Ezzikouri S，Chemin I，Chafik A，et al.Genotype determination in Moroccan hepatitis B chronic carriers［J］.Infect Genet Evol，2008，8（3）：306－312.

［7］Kao PC，Wu JF，Ni YH，et al.Tumour necrosis factor－α promoter region polymorphisms affect the course of spontaneous HBsAg clearance［J］.Liver Int，2010，30（10）：1448－1453.

［8］Zhou J，Huang JD，Poon VK，et al.Functional dissection of an IFN－alpha／beta receptor 1 promoter variant that confers higher risk to chronic hepatitis B virus infection［J］.J Hepatol，2009，51（2）：322－332.

［9］Ben－Ari Z，Mor E，Papo O，et al.Cytokine gene polymorphisms in patients infected with hepatitis B virus［J］.Am J Gastroenterol，2003，98（1）：144－150.

［10］卜范峰，魯艷芹，韓金祥，等.實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)乙型肝炎病毒拉米呋定耐藥突變及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2008，21（9）：806－809.

［11］鄧樂(lè).乙型肝炎病毒基因型與抗病毒藥物療效關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.臨床肝膽病雜志，2012，28（6）：469－473.

［12］劉艾芹，唐曙明，陳衛(wèi)布，等.深圳地區(qū)乙型肝炎病毒基因分型與耐藥性研究［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（14）：1787－1788.

［13］Toan NL，Song le H，Kremsner PG，et al.Impact of the hepatitis B virus genotype and genotype mixtures on the course of liver disease in Vietnam［J］.Hepatology，2006，43（6）：1375－1384.

［14］Pas SD，Tran N，De Man RA，et al.Comparison of reverse hybridization，microarray，and sequence analysis for genotyping hepatitis B virus［J］.J Clin Microbiol，2008，46（4）：1268－1273.

［15］李穗雯.單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（12）：1559－1561.

［16］Han Y，Zhang Y，Mei Y，et al.Analysis of hepatitis B virus genotyping and drug resistance gene mutations based on massively parallel sequencing［J］.J Virol Methods，2013，198（2）：341－347.