坤靈片中延胡索乙素含量測(cè)定的研究＊

萬峰峰 楊 靜 蔡慧俠 楊飛快 西安大恒制藥有限公司（西安710118）

Δ西安金花制藥廠（西安710065）

坤靈片為中藥復(fù)方制劑，是由處方1中香附（制）、黃芪、益母草、五味子、白芍等17味藥材和處方2中香附（制）、阿膠、牡丹皮、延胡索、當(dāng)歸、紅參等15味藥材組方［1］，由坤靈丸改變制劑成型工藝而成。具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，逐瘀生新的功效。用于月經(jīng)不調(diào)，或多或少，行經(jīng)腹痛，子宮寒冷，久不受孕，習(xí)慣性流產(chǎn)，赤白帶下，崩漏不止，病久氣虛，腎虧腰痛。其中延胡索所含的延胡索乙素等具有顯著延長(zhǎng)痛經(jīng)模型大鼠的潛伏期及減少扭體次數(shù)的作用［2］。筆者保持原丸劑劑型的提取和粉碎干燥工藝，僅改變成型工藝，將其制成坤靈片，并研究了其延胡索乙素含量測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥1.1 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1100四元梯度泵；VWD檢測(cè)儀；Agilent 1100在線脫氣機(jī)；Agilent 1100化學(xué)工作站（美國安捷倫公司）；色 譜 柱：迪 馬 Diamonsil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；AL204－IC型電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司）、BP211D型電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2 試藥 對(duì)照品為延胡索乙素（批號(hào)：110728－200908，含量測(cè)定使用、從中國藥品生物制品檢定所購買）。坤靈片為實(shí)驗(yàn)室自制；硅膠G從青島海洋化工廠采購；試劑中甲醇使用色譜純（Fisher公司），水采用重蒸餾水，其他所用試劑則是分析純。

2 延胡索乙素的含量測(cè)定2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為迪馬Diamonsil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇－0.1%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)Ph值至6.0）（63∶37）；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。樣品檢測(cè)量為10μL。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，其它組分及延胡索乙素色譜峰均能夠與基線分離，延胡索乙素色譜峰與互相鄰近的色譜峰分離度都大于1.5，且理論塔板數(shù)大于3000［3］。

2.2 制備對(duì)照品溶液的方法 將延胡索乙素對(duì)照品精密稱取適量，加入甲醇，制備溶液中每1mL含30μg，得到對(duì)照品溶液。

2.3 制備供試品溶液的方法 取供試品40片，研至細(xì)粉，混合均勻，取約9.5g，精密稱定，放于平底燒瓶中，將濃氨試液－甲醇（1∶20）混合溶液精密加入50mL，稱定物料及瓶體總重量，先冷浸1h，再加熱回流1h，放冷，再次稱定物料及瓶體總重量，使用濃氨試液－甲醇（1∶20）混合溶液將減失的重量補(bǔ)足，搖至均勻，進(jìn)行過濾。將續(xù)濾液精密吸取25mL，蒸至干燥，將殘?jiān)屑铀?0mL，攪拌溶解，用稀鹽酸調(diào)Ph值2～3，用石油醚（60℃～90℃）振搖提取2次，每次20mL，再用10mL石油醚（60℃～90℃）振搖提取1次，合并石油醚層，用水10mL振搖提取1次，水相用石油醚（60℃～90℃）5mL振搖提取1次，棄去石油醚層，合并水層，用濃氨試液調(diào)Ph值9～10，用石油醚（60℃～90℃）振搖提取3次，每次40mL，再用30mL石油醚（60℃～90℃）振搖提取1次，合并石油醚層，用水30mL振搖提取2次，石油醚層蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移到5mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖至均勻，樣品過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液。

2.4 制備陰性樣品檢測(cè)用溶液的方法 除去延胡索以外的組方藥材，均按照處方量稱量，并采用規(guī)定的制備工藝完成樣品制備，取得陰性樣品（缺延胡索藥材），按2.3中制備供試品溶液的方法進(jìn)行制備，即得陰性樣品檢測(cè)用溶液。

2.5 測(cè)定方法及檢測(cè)結(jié)果 分別精密量取按照2.2、2.3、2.4方法制備的對(duì)照品、陰性樣品及供試品的溶液各10μL，按照液相色譜儀操作要求及2.1要求的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，各色譜峰均峰形良好，理論塔板數(shù)及分離度均達(dá)到要求。供試品溶液的HPLC圖中，在延胡索乙素對(duì)照品溶液的出峰位置能夠檢出相應(yīng)色譜峰。而缺延胡索的陰性樣品溶液的HPLC圖中，延胡索乙素對(duì)照品出峰位置沒有檢測(cè)到其它色譜峰，說明采用2.1方法中的色譜條件對(duì)陰性樣品（缺延胡索）進(jìn)行檢測(cè)，不會(huì)產(chǎn)生相關(guān)干擾。

2.6 對(duì)線性關(guān)系進(jìn)行的相關(guān)考察 精密稱定延胡索乙素對(duì)照品6.67mg，加甲醇制成每mL含33.35μg的對(duì)照品溶液。將2.2中制備的延胡索乙素對(duì)照品溶液精密吸取 3μL、6μL、9μL、12μL、15μL 和18μL，分次注入至液相色譜儀中，按照2.1方法中的色譜條件對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定，橫坐標(biāo)X為進(jìn)樣量（ug），縱坐標(biāo)Y為平均峰面積，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程計(jì)算為：Y＝893.04X－2.75 r＝0.9999，線性范圍：0.10005～0.6003μg［4］。

2.7 對(duì)精密度進(jìn)行的相關(guān)研究 將樣品溶液精密吸取10μL，連續(xù)并且重復(fù)的進(jìn)樣6次，對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定，延胡索乙素測(cè)得峰面積，RSD為1.34%（n＝6），說明該儀器精密度符合要求。

2.8 對(duì)供試品穩(wěn)定性進(jìn)行的相關(guān)研究 取同一次制備的供試品溶液，放置在室溫下，于0、1、4、8和24 h分別測(cè)定，樣品檢測(cè)量為10μL。測(cè)量得到延胡索乙素的峰面積，經(jīng)過計(jì)算，RSD求得為1.70%。該結(jié)果說明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.9 對(duì)重復(fù)性進(jìn)行的相關(guān)研究 取同一次制備的樣品6份，分別按2.1中含量測(cè)定的方法對(duì)延胡索乙素含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得RSD為1.67%。該結(jié)果說明，該方法重現(xiàn)性符合要求［5］。

2.10 對(duì)回收率進(jìn)行的相關(guān)研究 使用加樣回收法，將已知含量的供試品（批號(hào)：20100501，含量：11.12μg/片）稱取6份，各精密加入延胡索乙素對(duì)照品溶液（396μg/mL）0.5mL，按供試品制備方法和2.1中含量檢測(cè)的方法進(jìn)行測(cè)定，得到延胡索乙素的平均回收率為96.55%，RSD為0.99%。測(cè)定數(shù)據(jù)見表1。

表1 延胡索乙素回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.11 對(duì)樣品的含量進(jìn)行測(cè)定 按2.1方法中的檢測(cè)條件對(duì)5批樣品中延胡索乙素進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定數(shù)據(jù)見表2。

表2 延胡索乙素檢測(cè)結(jié)果

3 討論與小結(jié)關(guān)于延胡索中所含延胡索乙素的含量測(cè)定，參照2010版一部藥典［6］延胡索藥材項(xiàng)下的延胡索乙素含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，采用原流動(dòng)相比例甲醇－0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)Ph值至6.0）（55∶45）時(shí)，保留時(shí)間過長(zhǎng)，在30min左右，且峰分離度差，背景較高，改進(jìn)供試品處理方法并改變流動(dòng)相比例（63∶37）后，樣品HPLC延胡索乙素色譜峰分離良好，保留時(shí)間在20min左右，理論塔板數(shù)3000以上，基本可達(dá)基線分離，并能較好地和其他雜質(zhì)峰分離。改進(jìn)后的含量測(cè)定方法更加簡(jiǎn)便、高效。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑部頒標(biāo)準(zhǔn)［M］.北京中華人民共和國衛(wèi)生部，1996：84.

［2］陳岳濤，曹 蔚，謝艷華，等，元胡止痛片及其重要成分對(duì)大鼠室驗(yàn)性痛經(jīng)的影響［J］.陜西中醫(yī)，2013，34（1）：111－113.

［3］張曉紅 ，王月茹，盧新義，等.高效液相色譜法測(cè)定千金救心膠囊中延胡索乙素含量［J］.陜西中醫(yī)，2013，34（7）：895－897.

［4］王新曉，盧劍鋒.高效液相色譜法測(cè)定小兒清熱口服液中綠原酸的含量［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（4）：483－484.

［5］惠婷婷，夏忠庭，張?zhí)m蘭，等.HPLC測(cè)定郁舒顆粒芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的含量［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（4）：480－481.

［6］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：123.