七厘散含藥血清對(duì)乳鼠毛囊成纖維細(xì)胞增殖的影響＊

劉愛(ài)軍 陳杏曄 廣州中醫(yī)藥大學(xué)組胚教研室（廣州510006）

△廣州中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)研究生（廣州510006）

皮膚覆蓋在人體表面，在日常生活中極易受到損傷，毛囊真皮的成纖維細(xì)胞（fibroblast）能分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN（fibronectin）等ECM成分和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（base fibroblast growth factor，bFGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多種細(xì)胞因子，能促進(jìn)各種生長(zhǎng)因子的分泌，誘導(dǎo)皮膚表皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的完整修復(fù)。七厘散是著名的傷科常用中成藥，本項(xiàng)目組前期研究證明七厘散能促進(jìn)創(chuàng)面成纖維細(xì)胞分泌膠原纖維，促進(jìn)新生毛細(xì)新生，修復(fù)表皮和毛囊，但中藥促進(jìn)皮膚愈合的作用機(jī)理并不清楚。本文通過(guò)探討七厘散含藥血清對(duì)分離培養(yǎng)的SD乳鼠觸須部毛囊真皮根鞘細(xì)胞增殖的影響，為更加深入的研究中藥促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的分子機(jī)制；尋找切實(shí)、有效的藥物作用靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生3d的SD乳鼠（雌雄不拘），用于取觸須部毛囊。雄性SD大鼠（質(zhì)量180－200g），用于制備含藥血清。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 HG－DMEM培養(yǎng)（美國(guó)Gibco公司）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；青霉素/鏈霉素（Hyclone公司）；0.01mmol/L PBS（Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；RT－2100C酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Ⅰ抗：層黏連蛋白（Laminin，LN）、纖黏連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）、波形蛋白（Vimentin）（均購(gòu)自武漢博士德試劑公司）；Ⅱ抗IgG、SABC－Cy3試劑盒（武漢博士德試劑公司）；核熒光標(biāo)記物DAPI（美國(guó)Sigma公司）。中成藥七厘散（批號(hào)：0100033，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠）

1.3 方法

1.3.1 SD乳鼠毛囊真皮細(xì)胞的獲取 將出生3d的同一胎次的、正常發(fā)育的SD乳鼠10只浸泡于75%酒精中，5min×3次。剪去帶有完整觸須部毛囊的皮膚，雙抗D－Hank’s液洗1次，無(wú)雙抗D－Hank’s液洗2次。超凈工作臺(tái)內(nèi)分離出完整的觸須毛囊，均勻置于T25培養(yǎng)瓶，添加少量10%FBS的HGDMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，24h后添加培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)滿后按1∶3進(jìn)行傳代。

1.3.2 細(xì)胞爬片的制作 將P2代細(xì)胞消化稀釋成細(xì)胞懸液，按1×107/L接種于放有消毒蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔接種1mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿蓋玻片50%左右時(shí)，取出蓋玻片，0.01mmol/L PBS洗3次，中性甲醛固定30min，0.01mmol/L PBS洗3次。

1.3.3 免疫熒光顯微鏡檢測(cè) P3代毛囊真皮細(xì)胞爬片，免疫熒光檢測(cè)LN、FN、Vimentin的表達(dá)（實(shí)驗(yàn)步驟按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），Ⅰ抗效價(jià)均為1∶100，Ⅱ抗效價(jià)1∶100，SABC－Cy3顯色后，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.4 七厘散含藥血清的制備 七厘散灌胃液按0.15g/1.5mL配制，每天每只大鼠灌胃兩次，間隔12h，灌胃量1.5mL/200g，連續(xù)灌胃，分別在3d、5d、7d腹主動(dòng)脈血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共灌胃5只大鼠，取血當(dāng)日早晨再灌胃1次，間隔1h，麻醉大鼠，打開(kāi)腹腔，負(fù)壓管抽腹主動(dòng)脈血。靜置30min，3000r/min離心10min，吸取上層血清，將所得同一時(shí)間點(diǎn)的5只大鼠的血清混合，50℃滅活30min，0.2μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 MTT檢測(cè) 七厘散含藥血清對(duì)P3代毛囊真皮細(xì)胞增殖的影響 將P2代毛囊細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按3000個(gè)/孔種植入96孔板，24h后更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；24h后棄培養(yǎng)基，將細(xì)胞分成空白對(duì)照組、無(wú)血清組、0%含藥血清組、2.5%含藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組，F(xiàn)BS補(bǔ)足血清總體積百分比為20%，每組7個(gè)復(fù)孔，分別添加相應(yīng)的藥物100μL/孔；24h后棄培養(yǎng)基，加入0.5mg/mL MTT 100μL/孔；37℃、5%CO2條 件 下 放 置 4h，加 DMSO100μL/孔，震蕩10min，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析（one－way ANOVA）進(jìn)行組間均數(shù)的比較，兩兩組間均數(shù)比較視方差齊性檢驗(yàn)（以0.1作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行Levene檢驗(yàn)）結(jié)果，當(dāng)方差齊同時(shí)，用LSD檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SD乳鼠毛囊細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)果 種植后細(xì)胞很快貼壁，24h后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈，可見(jiàn)從SD乳鼠毛囊有成纖維狀細(xì)胞遷出（圖1），3d細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶約80%左右，進(jìn)行傳代，殘留的毛囊及組織塊隨著傳代和換液逐漸除去，細(xì)胞傳至P3代時(shí)呈較純化的成纖維狀細(xì)胞（圖2）。

2.2 SD乳鼠毛囊真皮細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

分離培養(yǎng)的SD乳鼠毛囊真皮成纖維狀細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)FN（圖3）、LN（圖4）、Vimentin（圖5）表達(dá)陽(yáng)性。

2.3 MTT檢測(cè)七厘散含藥血清對(duì)P3代毛囊真皮細(xì)胞增殖的影響 七厘散灌胃后，3d、5d、7d含藥血清對(duì)P3代毛囊真皮細(xì)胞24h增殖的作用趨勢(shì)相同，均在含藥血清5%組對(duì)細(xì)胞促增殖作用達(dá)到最大，并且促增殖作用優(yōu)于普通的胎牛血清；之后隨著含藥血清體積百分比增加促增殖作用下降。3d和5d含藥血清組的促增殖作用優(yōu)于7d含藥血清組。

表1 七厘散含藥血清作用24h對(duì)SD乳鼠毛囊成纖維細(xì)胞增殖的影響

取3d、5d、7d含藥血清組的數(shù)值分別進(jìn)行單因素ANOVA分析，3d組F＝0.014，采用LSD法，發(fā)現(xiàn)不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清組間有顯著性差異（P＝0.03），3d含藥血清組中5%含藥血清組刺激細(xì)胞增殖效果最佳；5d組、7d組方差不齊（分別為F＝0242，F(xiàn)＝0.219），用Tamhane’s T2檢驗(yàn)方法，空白組與其他組之間有顯著性差異（P＜0.004），其它組間差異均無(wú)顯著性意義（P＞0.05），可見(jiàn)3d組5%七厘散含藥血清對(duì)細(xì)胞促增殖作用最好。

3 討 論FSC是組織工程皮膚理想的種子細(xì)胞，但是毛囊干細(xì)胞的有效增殖和定向分化至今仍未解決［1－4］。毛囊真皮根鞘中的成纖維細(xì)胞能分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN等ECM 成分和bFGF、VEGF、EGF等多種細(xì)胞因子［5，6］，能促進(jìn)FSC分化為表皮細(xì)胞并促進(jìn)毛囊的完整修復(fù)，因此深入研究毛囊真皮鞘成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性、利用其改善毛囊干細(xì)胞的增殖和定向分化能力具有重要意義。

七厘散是著名的傷科常用中成藥，廣泛應(yīng)用于外科瘡瘍、燙傷、跌打損傷、金刃重傷等病癥，療效顯著。本項(xiàng)目組前期研究證明七厘散作用于小鼠觸須部去表皮創(chuàng)面，具有明顯的抗炎、促修復(fù)作用。創(chuàng)面修復(fù)早期有大量炎細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)；修復(fù)中期表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖明顯，膠原纖維的合成和分泌增加；修復(fù)晚期真皮膠原纖維排列規(guī)則，新生毛細(xì)血管較多，創(chuàng)面表皮修復(fù)，毛囊重新形成，其療效優(yōu)于臨床西藥EGF，說(shuō)明中藥通過(guò)對(duì)創(chuàng)面微環(huán)境的改善，促進(jìn)膠原纖維的合成和分泌，膠原纖維能有效促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移和分化［7］，能促進(jìn)表皮及毛囊的重新生成［8］。

本實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測(cè)所分離培養(yǎng)的毛囊真皮細(xì)胞FN、LN、Vimentin表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。七厘散灌胃后3d、5d、7d的含藥血清按不同體積百分比作用于體外培養(yǎng)的毛囊真皮成纖維細(xì)胞24h，7d七厘散含藥血清組較3d組和5d組促增殖作用較差。七厘散含藥血清體積百分?jǐn)?shù)5%促增殖效果最佳，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析發(fā)現(xiàn)，3d組和5d組優(yōu)于7d組，且3d組和5d組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明灌胃3d即為最佳的時(shí)間點(diǎn)。每組中均隨著七厘散含藥血清體積百分比增加，促毛囊真皮成纖維細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)，當(dāng)七厘散含藥血清體積百分?jǐn)?shù)5%促增殖效果最佳，之后隨著含藥血清體積百分比增加，促增殖作用下降，說(shuō)明七厘散對(duì)真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是雙向的，在創(chuàng)傷修復(fù)中以促增殖為主，當(dāng)修復(fù)到一定程度，促增殖作用下降，防止膠原纖維過(guò)度堆積，形成瘢痕組織，充分體現(xiàn)了中藥促進(jìn)皮膚愈合的整體性和雙向性調(diào)節(jié)［9，10］。

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