歸腎丸對DOR小鼠卵巢超微結構的影響＊

崔丹丹 馬雯雯 文 露 宋坤琨 丁嘉慧 黃 聰 張明敏

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結合研究所，武漢 430030

近年來，隨著生活壓力的增加，女性絕經年齡提前，卵巢功能低下現(xiàn)象日趨嚴重。卵巢儲備功能，又稱卵巢儲備（ovarian reserve），是指卵巢皮質區(qū)卵泡生長、發(fā)育、并形成可受精的卵母細胞的能力，能反映女性的生育潛能和生殖內分泌功能。若卵巢內存留的可募集卵泡數(shù)目減少及卵子質量下降則稱為卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR），常伴有經量減少，月經稀發(fā)甚至閉經、不孕等，嚴重影響患者的身心健康，乃至家庭的穩(wěn)定，所以積極防治十分必要。DOR的發(fā)病率國內尚未見報道，但有日益增多的趨勢。DOR進一步可發(fā)展為卵巢早衰，而卵巢早衰病因不明［1－3］，治療頗為棘手，尚無有效治療措施，因此如何減緩卵巢功能衰退的速度以恢復卵巢功能，進而提高生活質量，是目前生殖內分泌研究的一項重要課題。

傳統(tǒng)中醫(yī)典籍尚無DOR相對應病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬“月經后期或過少”、“閉經”、“血枯”、“血隔”、“斷經前后諸證”、“不孕”等范疇，目前尚缺乏系統(tǒng)、全面的理論闡述和證治方法。但從補腎調沖著手辨證論治，顯示了中醫(yī)藥療效的優(yōu)勢。本研究用C57BL／6J小鼠通過連續(xù)超促排卵及臭氧接觸建立生理性卵巢衰老模型，也即是DOR模型，探討歸腎丸對DOR小鼠的顆粒細胞超微結構的影響，為臨床運用中藥治療卵巢功能衰退提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級5周齡C57BL／6J雌性小鼠，由武漢大學實驗動物中心提供。所有小鼠均飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心屏障系統(tǒng)。嚴格保證飼養(yǎng)環(huán)境為12h光照，12h暗室，溫度為18～22℃，相對濕度為70%～85%。雌雄分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食（標準飲食）。

1.2 主要試劑與儀器

歸腎丸為配方顆粒組方，顆粒制劑由三九醫(yī)藥制品有限公司提供，組方為：熟地濃縮顆粒6.0g（等于熟地20g），山茱萸濃縮顆粒1.7g（等于山茱萸10 g），山藥濃縮顆粒1.5g（等于山藥10g），菟絲子濃縮顆粒0.5g（等于菟絲子10g），枸杞濃縮顆粒4.0g（等于枸杞10g），杜仲濃縮顆粒0.5g（等于杜仲10 g），當歸濃縮顆粒3.0g（等于當歸10g），茯苓濃縮顆粒1.0g（等于茯苓10g）組成。人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）購自麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司，孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）購自杭州動物藥品廠。蘇木精－伊紅試劑購自湖北百奧斯生物科技有限公司，F(xiàn)EI－Tecnai G212型透射電子顯微鏡購自荷蘭FEI電子光學有限公司。

1.3 模型建立及分組

小鼠適應性飼養(yǎng)7d左右，其后進行陰道涂片，觀察動情周期，將連續(xù)2個動情周期正常的小鼠納入實驗，共16只小鼠隨機分為正常組、模型組、歸腎丸組和脫氫表雄酮（DHEA）組。參照 Miyamoto等［4］的方法，除正常組外的其他三組予以腹腔注射5IU PMSG，54h后給予5IU HCG腹腔注射，19h后再行25IU PGF2α腹腔注射。3次注射為1個周期，12h后開始下1個周期，共進行10個周期。同時，實驗期間每天21∶00～次日9∶00將小鼠放入臭氧接觸箱中，保持臭氧接觸箱中臭氧濃度穩(wěn)定在2.8mg／m3。而正常組則接受生理鹽水腹腔注射，常規(guī)飼養(yǎng)。第10次連續(xù)超排HCG腹腔注射完成后次日上午，正常組及模型組給予生理鹽水0.3ml灌胃，歸腎丸組與DHEA組則給予相應藥物灌胃，藥物劑量按照小鼠與人體表面積轉換系數(shù)計算后，每只小鼠每天灌胃0.3 ml。第21天灌胃結束后于動情后期頸椎脫臼處死，均從背腹側剖腹，迅速取出雙側卵巢，共得32個卵巢，其中16個卵巢放入2.5%戊二醛電鏡固定液，其余卵巢放入4%多聚甲醛固定。

1.4 蘇木精－伊紅染色觀察卵巢形態(tài)

卵巢固定包埋后，沿縱軸行連續(xù)切片，厚度為4μm，每2～3片貼于一張載玻片，采用蘇木精－伊紅染色，光學顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)。

1.5 電鏡超微結構觀察

卵巢組織塊用2.5%戊二醛與1%鋨酸雙固定，丙酮逐級脫水，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，于電子顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 各組卵巢蘇木精－伊紅染色

正常組小鼠卵巢內可見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡、初級卵泡位于淺層，數(shù)目較多，體積小，呈圓形或橢圓形；生長卵泡大小不一，成熟卵泡多位于淺表部，可見卵泡腔、卵細胞及卵丘結構；顆粒細胞呈多層，形態(tài)完整，排列整齊，卵泡膜細胞呈梭形排列。模型組小鼠卵巢皮質變薄，初級卵泡含量降低，多數(shù)卵泡呈囊性擴張，擴張的卵泡壁顆粒層細胞層次明顯減少，黃體計數(shù)較少；歸腎丸組與DHEA組中則可見卵巢皮質間質細胞增生，同時可見皮質內出現(xiàn)許多初級卵泡、生長卵泡及少量成熟卵泡，顆粒細胞層數(shù)增加，黃體組織數(shù)量增多。見圖1。

2.2 卵巢透射電鏡結果

正常組的卵泡顆粒細胞，可見線粒體形態(tài)規(guī)則，管型明顯，數(shù)量豐富，且脂滴較多；模型組中線粒體腫脹明顯，還出現(xiàn)了空泡化改變，且較少看到脂滴，胞質濃縮；歸腎丸組與DHEA組電鏡下均可見顆粒細胞內線粒體豐富，管型為管狀脊，胞質內含有大量脂滴。見圖2。

圖1 各組小鼠卵巢組織光鏡圖（蘇木精－伊紅染色，×400）

圖2 各組小鼠卵巢超微結構改變

3 討論

近年來，由于生活工作壓力的增加，環(huán)境的影響，以及不孕癥人口高齡化，卵巢儲備功能降低的患者逐漸增多，改善卵巢儲備功能降低患者的情況，提高妊娠率，是當今生殖醫(yī)學和生殖健康研究的一個熱點和難點。卵巢功能低下是卵巢早衰的前奏，應給予高度的重視和積極的治療。本實驗采用序貫連續(xù)超排卵10次以及臭氧吸入來造模，旨在觀察歸腎丸對卵巢功能衰退小鼠超微結構的影響。

造模根據(jù)是基于自由基理論，由活性氧等引起的細胞內氧化損傷是造成衰老的重要因素［5－6］，而連續(xù)超排卵能降低始基卵泡池的假說。新生兒的卵巢中約含有200萬個始基卵泡，而到絕經時，卵巢中還剩下大約1 000個卵泡［7－8］。婦女在絕經前，不間斷地卵泡發(fā)育（卵泡發(fā)育不同時期）展示了一種選擇性的生理性細胞死亡過程：大多數(shù)卵泡最終閉鎖消失，僅有不到1%的卵泡發(fā)育成熟、排卵。雖然卵泡閉鎖基本機制目前還不完全清楚，但越來越多的研究［9－10］表明，顆粒細胞凋亡觸發(fā)了卵泡閉鎖。本實驗研究結果顯示，正常組光鏡下可見到卵巢皮質內有較多的各級生長卵泡、成熟卵泡及黃體，而模型組生長卵泡較少，且電鏡觀察到其卵巢顆粒細胞內線粒體較少，還出現(xiàn)了空泡化改變，且較少看到脂滴。而歸腎丸組與DHEA組，光鏡檢測結果顯示，均可見各級生長卵泡及成熟卵泡、黃體數(shù)目均較多。電鏡下可見其線粒體豐富，管型明顯，胞質內有大量脂滴。膽固醇是合成性激素的重要原料，當細胞內含大量的膽固醇時則以脂滴形式存在［11］。有報道［12］稱，高電子密度脂滴在較年輕顆粒細胞中比較常見，但在年紀較大的顆粒細胞中基本不出現(xiàn)，這與本文的結果一致。因此推斷連續(xù)超排聯(lián)合臭氧吸入可能通過影響細胞內脂肪代謝，進而導致甾體激素合成的下降，造成卵巢功能低下，而歸腎丸明顯能夠改善其卵巢超微結構，是否能夠導致甾體激素合成的增加，尚需進一步深入的研究。

近年來，DOR病例在臨床上比較常見，對其產生的病理機制仍不十分清楚，治療多以激素為主。許多研究［13－15］顯示，DHEA 可以改善卵巢儲備功能，提高妊娠率，降低流產率，也有報道［16］稱，DHEA能提高卵巢反應不良患者的雄激素水平，有效改善其卵巢儲備功能和促排卵效果，進而提高IVF－ET的妊娠率。故本實驗使用DHEA作為對照治療組。DOR在中醫(yī)學范疇屬于月經不調、經斷前后諸證、不孕等。由于腎在中醫(yī)理論中對于女性生殖生理非常重要，如《素問·上古天真論》云：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長；二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”。故認為腎虛乃DOR的主要病理基礎。本實驗選用具有補腎作用的歸腎丸，研究其對DOR模型小鼠卵巢超微結構的影響，以期給臨床治療提供強有力的依據(jù)。

本實驗結果提示，歸腎丸能改善DOR模型小鼠顆粒細胞線粒體腫脹、空泡化以及脂滴的情況，而顆粒細胞線粒體的改變是否會導致顆粒細胞的凋亡，脂滴的減少是否會導致甾體類激素的下降，尚需要進一步的研究。

［1］龔萍，張明敏.卵巢早衰的中西醫(yī)治療進展［J］.中西醫(yī)結合研究，2010，2（6）：321－322，324.

［2］黃光英，畢桂娟.卵巢早衰的中西醫(yī)結合研究［C］.2010全國中西醫(yī)結合圍絕經期專題學術會議論文集.上海：2010：4－7.

［3］鄭翠紅，黃光英.對卵巢早衰的中西醫(yī)認識［J］.中西醫(yī)結合研究，2012，4（3）：150－155.

［4］MIYAMOTO K，SATO EF，KASAHARA E，et al.Effect of oxidative stress during repeated ovulation on the structure and functions of the ovary，oocytes，and their mitochondria［J］.Free Radic Biol Med，2010，49（4）：674－681.

［5］ALEXEEFF SE，LITONJUA AA，WRIGHT RO，et al.O－zone exposure，antioxidant genes，and lung function in an elderly cohort：VA normative aging study［J］.Occup Environ Med，2008，65（11）：736－742.

［6］HARMAN D.The free radical theory of aging［J］.Antioxid Redox Signal，2003，5（5）：557－561.

［7］HANSER KR，KNOWLTON NS，THYER AC，et al.A new model of reproductive aging：the decline in ovarian non－growing follicle number from birth to menopause［J］.Human Reproduction，2008，23（3）：699－708.

［8］SKINNER MK.Regulation of primordial follicle assembly and development［J］.Hum Reprod Update，2005，11（5）：461－471.

［9］HUGHES FM Jr，GOROSPE WC.Biochemical identification of apoptosis（programmed cell death）in granulosa cells：evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia［J］.Endocrinology，1991，129（5）：2415－2422.

［10］TILLY JL，KOWALSKI KI，JOHNSON AL，et al.Involvement of apoptosis in ovarian follicular atresia and postovulatory regression［J］.Endocrinology，1991，129（5）：2799－2801.

［11］GARMEY JC，DAY RN，DAY KH，et al.Mechanisms of regulation of ovarian sterol metabolism by insulin－like growth factor type II：in vitro studies with swine granulosa cells［J］.Endocrinology，1993，133（2）：800－808.

［12］ROTMENSCH S，DOR J，F(xiàn)URMAN A，et al.Ultrastructural characterization of human granulosa cells in stimulated cycles：correlation with oocyte fertilizability［J］.Fertil Steril，1986，45（5）：671－679.

［13］安錦霞，王琰，倪亞莉，等.脫氫表雄酮（DHEA）預治療在體外受精－胚胎移植周期中的應用［J］.生殖與避孕，2013，33（2）：89－92.

［14］劉小古，周惠芳.脫氫表雄酮在卵巢儲備功能低下患者中的應用［J］.國際婦產科學雜志，2013，40（2）：116－119.

［15］趙紅翠，朱亮.脫氫表雄酮（DHEA）在輔助生殖技術中的研究進展［J］.生殖與避孕，2012，32（2）：118－123.

［16］鹿群，沈浣，王叢，等.脫氫表雄酮對卵巢反應不良患者體外受精－胚胎移植的影響［J］.山東大學學報（醫(yī)學版），2013，51（2）：84－87，92.