嗅三針治療對(duì)阿茨海默病模型大鼠海馬蛋白激酶A活性的影響＊

牛文民 劉智斌 楊曉航 王 淵

陜西中醫(yī)學(xué)院針灸系實(shí)驗(yàn)研究中心，西安 712046

阿茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是嚴(yán)重危害老年人生命健康和生活質(zhì)量的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。本研究團(tuán)隊(duì)多年來(lái)從事嗅三針療法治療AD的臨床及實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)該療法能夠有效干預(yù)AD病理過(guò)程［1－5］，本研究通過(guò)進(jìn)一步觀察嗅三針療法對(duì)AD大鼠海馬組織中蛋白激酶A（PKA）活性的影響，深入探討嗅三針治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇成年SD雄性大鼠50只，體重（300±10）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要儀器

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（北京現(xiàn)代太極電子有限公司）；Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－rad公司）。

1.3 大鼠模型制作

1.3.1 AD大鼠模型制作 將Aβ1～40肽段溶于滅菌蒸餾水中，濃度為5g／L，淀粉樣蛋白Aβ1～40試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，用前37℃孵育48 h，使其變?yōu)槟蹱顟B(tài)的Aβ。用10%水合氯醛（0.4 ml／100g體重）腹腔注射麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀。常規(guī)無(wú)菌操作，切開(kāi)皮膚，參照包新民等［6］繪制《大鼠腦立體定向圖譜》，選擇左側(cè)海馬為注射靶區(qū)（前囟后3.5mm，中縫左側(cè)旁開(kāi)2.0mm，硬腦膜下2.8mm）用牙科鉆在顱骨對(duì)應(yīng)位置開(kāi)直徑為1mm的2個(gè)小孔，暴露硬腦膜，微量進(jìn)樣器自腦表面垂直進(jìn)針2.8mm，將 Aβ1～40肽段2 μ（10 μg），緩慢（0.5 μl／min）注入，留針5min以保證溶液充分?jǐn)U散，然后緩慢撤針（3min），縫合切口。手術(shù)部位施以適量青霉素抗感染，常規(guī)飼養(yǎng)［7］。

1.3.2 AD嗅神經(jīng)切斷大鼠模型制作 參照羨慕等［8］報(bào)道的切斷嗅神經(jīng)方法，將AD造模后的大鼠用水合氯醛麻醉后，固定在立體定位儀上。在大鼠顱頂正中切開(kāi)皮膚，小范圍分離暴露前囟。在大鼠顱頂正中線(xiàn)位于前囟前面5mm兩側(cè)旁開(kāi)2mm處，分別鉆2個(gè)直徑為1mm的小孔，深度至暴露嗅球，但不損傷嗅球；使用顯微解剖鑷提起嗅球前端的硬腦膜，銳性切斷嗅神經(jīng)，盡量避免傷及嗅球，同時(shí)明膠海綿壓迫止血，傷口處點(diǎn)青、鏈霉素，縫合傷口。對(duì)照組僅于顱頂鉆孔后即縫合皮膚，不傷及嗅球及嗅神經(jīng)。

1.4 動(dòng)物分組及處理

將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、AD模型組、AD＋嗅神經(jīng)切斷模型組、嗅三針組和嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組，每組10只。嗅三針組和嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組均進(jìn)行嗅三針治療，正常對(duì)照組、AD模型組和AD嗅神經(jīng)切斷模型組，每日1次，采取與以上兩組相同的捉拿固定，但不施加任何干預(yù)措施。

嗅三針穴位定位：依據(jù)李忠仁教授［9］主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》動(dòng)物選穴標(biāo)準(zhǔn)，選取兩側(cè)迎香及印堂穴。迎香穴位于大鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無(wú)毛交界處；印堂穴位于大鼠兩眼眶上緣中點(diǎn)連線(xiàn)與正中線(xiàn)交點(diǎn)。操作：選用“華佗牌”不銹鋼針，30號(hào)0.5寸毫針。于迎香穴向內(nèi)上方斜刺0.3cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3cm；電針儀：G6805電針儀（上海醫(yī)療儀器廠(chǎng)）；刺激參數(shù)：疏密波，頻率80～100Hz；刺激強(qiáng)度：以保持針刺局部輕微抖動(dòng)為度（電流強(qiáng)度：1～3mA，電壓：1～3V）；時(shí)間：留針10min，持續(xù)電刺激，每日1次。5 d為1個(gè)療程，休息2d，共進(jìn)行6個(gè)療程。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn) 治療結(jié)束后，開(kāi)始水迷宮測(cè)試［10］。水迷宮內(nèi)水深41cm，水溫22～26℃。在水池壁標(biāo)明4個(gè)入水點(diǎn)，由此將水池等分為4個(gè)象限，任選一象限正中放置平臺(tái)，沒(méi)于水下1cm，水面覆蓋塑料泡沫。將受試大鼠按順時(shí)針?lè)较蛞来斡蒃、S、W、N 4個(gè)入水點(diǎn)順序面向池壁放入水中，記錄2min內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2min內(nèi)找到平臺(tái)，記錄其實(shí)際逃避潛伏期及游泳路程；如果大鼠在2min內(nèi)未找到平臺(tái)，由測(cè)試者將其引上平臺(tái)并停留10s，逃避潛伏期記錄為2min。歷時(shí)6d，每日1次。以6d找到平臺(tái)的平均逃避潛伏期和平均游泳路程評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5.2 海馬組織的PKA活性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后快速將大鼠斷頭取腦，分離海馬，取適量海馬組織樣品，迅速標(biāo)號(hào)放入EP管投入液氮中，隨后置于－70℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定海馬中的PKA活性。具體操作過(guò)程嚴(yán)格按照PKA酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究院）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析、組間均值進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)情況

大鼠6d平均逃避潛伏期和平均游泳路程比較，AD模型組及AD＋嗅神經(jīng)切斷組均顯著長(zhǎng)于正常組（P＜0.01）；嗅三針組與嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組均顯著短于 AD模型組（P＜0.01，P＜0.05）；嗅三針組短于嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組（P＜0.05）；AD模型組與AD＋嗅神經(jīng)切斷組相比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n＝10，±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n＝10，±s）

與模型組比較＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01；與嗅三針組比較△ P＜0.05

組別 平均逃避潛伏期（s）平均游泳路程（cm）正常對(duì)照組 18.25±9.25＊＊ 115.56±18.15＊＊ AD模型組 116.61±24.33 189.65±25.33 AD＋嗅神經(jīng)切斷組 123.95±25.36 185.58±25.21嗅三針組 76.16±10.12＊＊ 128.12±14.25＊＊ 嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組 95.12±15.12＊△ 152.18±15.12＊△

2.2 各組大鼠海馬組織PKA活性

各組大鼠海馬組織PKA活性比較，正常對(duì)照組、嗅三針組和嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組均明顯高于AD模型組（P＜0.01）；嗅三針組高于嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組（P＜0.05）；AD模型組與AD＋嗅神經(jīng)切斷組相比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬組織PKA活性的比較（n＝10，ng／L，±s）

表2 各組大鼠海馬組織PKA活性的比較（n＝10，ng／L，±s）

與模型組比較＊＊ P＜0.01；與嗅三針組比較△ P＜0.05

PKA正常對(duì)照組 456.65±73.15組別＊＊AD模型組 281.68±32.28 AD＋嗅神經(jīng)切斷組 270.86±32.34嗅三針組 369.88±65.31＊＊ 嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組 311.52±53.22＊＊△

3 討論

蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）是第二信使cAMP依賴(lài)的蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的重要激酶。細(xì)胞外刺激信號(hào)經(jīng)細(xì)胞膜受體使腺苷酸環(huán)化酶活化，從而催化ATP生成cAMP，由此激活PKA，促進(jìn)PKA進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)生磷酸化，最終激活cAMP反應(yīng)成分結(jié)合原件（cAMP－response element binding protein，CREB），啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，然后產(chǎn)生一系列功能調(diào)節(jié)活動(dòng)?，F(xiàn)已確認(rèn)，cAMP／PKA－CREB信號(hào)通路在學(xué)習(xí)與記憶形成機(jī)制中發(fā)揮著重要作用［11］。

有研究［12］證實(shí)，AD 的腦組織中cAMP／PKA／CREB信號(hào)通路明顯受損，尤其是海馬CA1區(qū)的PKA活性顯著降低，影響了突觸可塑性，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶特別是長(zhǎng)時(shí)程記憶形成障礙。有研究［13］表明，針刺治療能明顯提高AD大鼠海馬內(nèi)PKA的活性，從而恢復(fù)學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究結(jié)果顯示，嗅三針能夠明顯增強(qiáng)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并且能提高AD模型大鼠海馬組織中PKA的活性。然而，嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組雖然其學(xué)習(xí)記憶能力也有所增強(qiáng)，且海馬組織PKA的活性升高，但其水平不及嗅三針組，兩組結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明嗅三針對(duì)于AD大鼠的療效主要是通過(guò)嗅覺(jué)傳導(dǎo)通路對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響的，這與本團(tuán)隊(duì)先前的研究［1－5］結(jié)果相一致。

本研究證實(shí)了嗅三針療法對(duì)AD具有確切的治療作用，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)海馬組織PKA的活性密切相關(guān)，其療效的發(fā)揮有賴(lài)于嗅覺(jué)傳導(dǎo)通路的完整性。

［1］牛文民，劉智斌，楊曉航，等.嗅三針對(duì)癡呆大鼠海馬膽堿能系統(tǒng)功能影響［J］.針灸臨床雜志，2008，24（10）：38－39.

［2］劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針對(duì)老年癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬膽堿乙?；?、乙酰膽堿酯酶活性的影響［J］.針刺研究，2009，34（1）：48－51.

［3］劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針對(duì)癡呆大鼠大腦邊緣葉膽堿能系統(tǒng)功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（3）：206－207.

［4］劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬Bcl－2和Bax表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)［J］.針刺研究，2011，36（1）：7－11.

［5］楊曉航，劉智斌，牛文民，等.嗅三針對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬毒覃堿型受體的影響［J］.針刺研究，2011，36（2）：90－94.

［6］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.

［7］庫(kù)寶善.神經(jīng)精神藥理學(xué)［M］.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2006：479－480.

［8］羨慕，魏永祥，韓德民，等.嗅神經(jīng)切斷術(shù)后白血病抑制因子在嗅上皮中的表達(dá)［J］.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2005，12（6）：377－380.

［9］李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2004：327－329.

［10］MORRIS RG，GARRUD P，RAWLINS IN，et al.Place navigation impared in rats with hippocampal lessens［J］.Nature，1982，297（5868）：681－683.

［11］MUNNO DW，PRINCE DJ，SYED NI.Synapse number and synaptic efficacy are reguLated by presynaptic c－AMP and PKA［J］.J Neurosci，2003，23（10）：4146－4155.

［12］MATSUSHITA M，TOMIZAWA K，MORIWAKI A，et al.A high efficiency protein transduction system demonstrating the role of PKA in long lasting LTP.［J］.J Neuro Sci，2001，（21）：6000－6007.

［13］沈峰，孫國(guó)杰.電針對(duì)AD大鼠海馬PKA影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（4）：731－732.