熱纖梭菌內(nèi)切β—1，4—葡聚糖酶的克隆與表達

彭靜靜

摘要：將來源于熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）ATCC 27405的編碼內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)基因（celD）與熱激表達載體pHsh連接，得到重組表達載體pHsh-celD，并將重組表達載體pHsh-celD轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Escherichia coli BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中。結(jié)果表明，該重組酶的分子質(zhì)量為66 ku，與預(yù)期大小相符。基于表達載體pHsh的重組表達系統(tǒng)具有誘導表達簡便、誘導方式廉價的優(yōu)點，且重組酶熱穩(wěn)定性非常好，對該酶的大規(guī)模發(fā)酵應(yīng)用具有重要意義。

關(guān)鍵詞：熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）；纖維素酶；表達載體pHsh；克隆；表達

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4457-03

纖維素是地球上分布最廣、蘊藏量最豐富的生物質(zhì)，也是最廉價的可再生資源。纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶，能分解纖維素產(chǎn)生寡糖和纖維二糖，水解成為葡萄糖[1]。隨著纖維素酶在工業(yè)上廣泛地應(yīng)用，特別是在紡織工業(yè)、能源工業(yè)中，纖維素酶已成為最近十幾年酶工程研究的一個焦點。熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）ATCC 27405是一種高溫厭氧細菌，其合成的纖維素酶和半纖維素酶構(gòu)成多酶復(fù)合體，纖維素酶主要是由內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶（C1酶）、外切β-l，4-葡聚糖酶（Cx酶）和葡萄糖苷酶3種酶組成的。其中，內(nèi)切β-l，4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）是分解纖維素最主要的酶。嗜熱梭菌（Clostridium sp.）產(chǎn)生的纖維素酶耐熱性好，但是由于熱纖梭菌是一種嚴格的厭氧菌，培養(yǎng)條件極其苛刻，分泌纖維素酶必須在高度厭氧的條件下進行，且酶產(chǎn)量相對較低，不適合在工業(yè)中大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。而采用分子生物學手段，將嗜熱酶基因?qū)氪竽c桿菌（Escherichia coli）中高效表達是非常有效的方法[2-5]。

本試驗克隆了編碼內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)基因（celD），并連接到熱激表達載體pHsh上，得到重組質(zhì)粒pHsh-celD，并實現(xiàn)了此纖維素酶在大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中高效表達，為該酶在工業(yè)上的開發(fā)及利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

熱纖梭菌ATCC 27405（購于美國菌種保藏中心）采用厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)，55 ℃靜置培養(yǎng)8 h[6，7]。表達載體pHsh由泰山學院生物與釀酒工程學院構(gòu)建并保存，屬于熱激表達載體。該表達載體是由大腸桿菌σ32因子調(diào)控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激誘導外源基因表達[8，9]。

1.2 方法

1.2.1 celD基因的克隆與重組表達載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank上已提交的熱纖梭菌ATCC 27405纖維素酶基因（NC_009012）的序列，利用信號肽預(yù)測利用在線SignalP 3.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）設(shè)計了PCR擴增引物N-1：5′-AGACCAAAGTGTCAGCTGC-3′和C-1：5′-CCCCTCGAGTATTGGTAATTTCTCGATTAC-3′。以提取的熱纖梭菌ATCC 27405的基因組DNA為模板，進行PCR擴增celD基因。PCR擴增程序為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性25 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，切膠回收純化目的DNA片段。將經(jīng)Xho I酶切PCR回收產(chǎn)物和經(jīng)Stu I和Xho I雙酶切的表達載體pHsh連接，將連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，構(gòu)建含celD基因的重組表達載體pHsh-celD。

1.2.2 重組蛋白的表達與純化 重組質(zhì)粒pHsh-celD電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，挑取重組單菌落接種于含100 μg/mL的Amp的LB培養(yǎng)液中30 ℃振蕩培養(yǎng)。當培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8時轉(zhuǎn)入42 ℃水浴搖床進行熱激表達繼續(xù)培養(yǎng)8 h后離心收集菌體。用50 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液洗滌細胞2次后，用相同緩沖液重懸細胞，置于冰浴中用超聲波破碎儀破碎細胞。細胞碎片于12 000 r/min離心10 min，去除上清液即為粗酶液。將粗酶液在60 ℃熱處理30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min去除變性蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 celD基因的克隆與序列分析

熱纖梭菌ATCC 27405于厭氧管中55 ℃靜置培養(yǎng)8 h后，提取基因組DNA，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果如圖1A所示。根據(jù)GenBank上已提交的熱纖梭菌ATCC 27405纖維素酶基因（NC_009012）的序列大小為1 950 bp，PCR擴增celD基因的結(jié)果如圖1B所示，PCR擴增片段與預(yù)期大?。? 848 bp）相符。

2.2 重組表達載體pHsh-celD的構(gòu)建

PCR擴增得到celD基因片段經(jīng)Xho I單酶切后純化，與經(jīng)過Stu I和Xho I雙酶切的表達載體pHsh連接，得到重組表達載體pHsh-celD，其酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。

2.3 重組纖維素酶的表達及檢測

將重組表達載體pHsh-celD電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，挑取重組單菌落接種于含100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液中30 ℃振蕩培養(yǎng)。當培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8時轉(zhuǎn)入42 ℃水浴搖床進行熱激表達繼續(xù)培養(yǎng)8 h后離心收集菌體。SDS-PAGE分析結(jié)果（圖3）表明，重組菌均能產(chǎn)生約66 ku的特異條帶，與預(yù)期的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小一致。endprint

3 小結(jié)與討論

本研究采用了熱激載體pHsh作為表達載體，將來源于熱纖梭菌的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因在大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中成功表達。該表達載體是由大腸桿菌σ32因子調(diào)控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激就可以高效地表達外源基因，所以在誘導外源基因表達過程中就不需要加入化學誘導劑?；瘜W誘導劑如IPTG比較昂貴，是基因工程菌株在工業(yè)化應(yīng)用中的一個瓶頸問題，而熱激誘導能很好地降低了基因誘導表達成本，這無疑在工業(yè)化應(yīng)用中具有巨大的優(yōu)越性和現(xiàn)實意義[9，10]。本研究中利用熱纖梭菌的纖維素酶耐熱性，將重組菌細胞破碎后的上清液經(jīng)過60 ℃的熱處理后，純化出了可用于工業(yè)應(yīng)用的纖維素酶，極大地降低了下游處理成本。由于該酶的編碼基因含有較多的稀有密碼子，因此下一步考慮將其基因的稀有密碼子進行定點突變成大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子，通過對表達質(zhì)粒的TIR區(qū)域進行mRNA二級結(jié)構(gòu)分析后，優(yōu)化mRNA二級結(jié)構(gòu)，以進一步提高其表達水平。

參考文獻：

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3 小結(jié)與討論

本研究采用了熱激載體pHsh作為表達載體，將來源于熱纖梭菌的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因在大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中成功表達。該表達載體是由大腸桿菌σ32因子調(diào)控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激就可以高效地表達外源基因，所以在誘導外源基因表達過程中就不需要加入化學誘導劑?；瘜W誘導劑如IPTG比較昂貴，是基因工程菌株在工業(yè)化應(yīng)用中的一個瓶頸問題，而熱激誘導能很好地降低了基因誘導表達成本，這無疑在工業(yè)化應(yīng)用中具有巨大的優(yōu)越性和現(xiàn)實意義[9，10]。本研究中利用熱纖梭菌的纖維素酶耐熱性，將重組菌細胞破碎后的上清液經(jīng)過60 ℃的熱處理后，純化出了可用于工業(yè)應(yīng)用的纖維素酶，極大地降低了下游處理成本。由于該酶的編碼基因含有較多的稀有密碼子，因此下一步考慮將其基因的稀有密碼子進行定點突變成大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子，通過對表達質(zhì)粒的TIR區(qū)域進行mRNA二級結(jié)構(gòu)分析后，優(yōu)化mRNA二級結(jié)構(gòu)，以進一步提高其表達水平。

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3 小結(jié)與討論

本研究采用了熱激載體pHsh作為表達載體，將來源于熱纖梭菌的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因在大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中成功表達。該表達載體是由大腸桿菌σ32因子調(diào)控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激就可以高效地表達外源基因，所以在誘導外源基因表達過程中就不需要加入化學誘導劑?；瘜W誘導劑如IPTG比較昂貴，是基因工程菌株在工業(yè)化應(yīng)用中的一個瓶頸問題，而熱激誘導能很好地降低了基因誘導表達成本，這無疑在工業(yè)化應(yīng)用中具有巨大的優(yōu)越性和現(xiàn)實意義[9，10]。本研究中利用熱纖梭菌的纖維素酶耐熱性，將重組菌細胞破碎后的上清液經(jīng)過60 ℃的熱處理后，純化出了可用于工業(yè)應(yīng)用的纖維素酶，極大地降低了下游處理成本。由于該酶的編碼基因含有較多的稀有密碼子，因此下一步考慮將其基因的稀有密碼子進行定點突變成大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子，通過對表達質(zhì)粒的TIR區(qū)域進行mRNA二級結(jié)構(gòu)分析后，優(yōu)化mRNA二級結(jié)構(gòu)，以進一步提高其表達水平。

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