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    高同型半胱氨酸血癥患者氧化應(yīng)激指標(biāo)的研究

    2014-11-20 01:03:36蔣興亮劉素蘭易婷婷
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:脂質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞硬化

    蔣興亮, 劉素蘭, 易婷婷

    (川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川南充637000)

    高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HHcy)作為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與血管疾病存在著密切的聯(lián)系,其機(jī)制可能與對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的直接或間接損傷及基因毒性作用、增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth musole cell,VSMC)的增殖和遷移、改變血小板功能及影響凝血系統(tǒng)、促進(jìn)血管鈣化等幾個(gè)方面有關(guān)[1]。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)在體內(nèi)極易被氧化,在氧化的同時(shí),釋放出活性氧離子(reactive oxygen species,ROS),過(guò)量的 ROS引起分子、細(xì)胞和組織的損傷。ROS在心血管病變,尤其是動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中扮演重要角色[2]。目前國(guó)內(nèi)、外對(duì)HHcy患者氧化與抗氧化狀態(tài)研究較少,我們擬通過(guò)對(duì)HHcy患者血漿代表抗氧化狀態(tài)的循環(huán)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、對(duì)氧磷酯酶1(paraoxonase 1,PON1)活性,反映氧化程度的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(nitric oxide,NO)水平及一氧化氮合酶(nitric oxide synthose,NOS)活性的測(cè)定,觀察 HHcy患者氧化與抗氧化狀態(tài),以探討Hcy致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。

    材料和方法

    一、研究對(duì)象

    以空腹血漿Hcy≥15μmo l/L為診斷HHcy的標(biāo)準(zhǔn),選擇2011年10月至2012年2月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院患者108例,其中男78例,女30例,年齡25~68歲。根據(jù)血漿Hcy升高的程度將HHcy分為輕度(16~30μmol/L)、中度(31~100 μmol/L)和重度(>100 μmol/L)[3],其中輕度組50例、中度組40例、重度組18例。排除冠心病、糖尿病、高血壓、甲狀腺功能異常、急性感染、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤、接受器官移植的患者和近6個(gè)月內(nèi)服用葉酸、維生素B6、維生素B12以及影響Hcy水平的藥物(如卡馬西平、苯妥英鈉等)。以同期川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診健康體檢者106名作為正常對(duì)照組,其中男66名,女40名,年齡29~65歲,其年齡和性別與HHcy組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),全部經(jīng)體格檢查和血生化、心電圖、腹部B超等檢查無(wú)心、肝、腎疾病及糖尿病。

    二、方法

    1.標(biāo)本收集 所有受檢者禁食12 h,于清晨采集靜脈血液,肝素抗凝,分離血漿,置-20℃保存?zhèn)錂z。

    2.血漿PON1活性測(cè)定[4]采用速率法測(cè)定PON1活性。取試劑1(0.05 mol/L甘氨酸緩沖液,pH 值 10.5,含 1 mmol/L CaCl2、1 mol/L NaCl)150μL,試劑2(試劑1中含1 mol/L對(duì)氧磷)50μL,標(biāo)本8μL,測(cè)定350~500 s內(nèi)對(duì)硝基苯酚產(chǎn)生的速度,波長(zhǎng)410/340 nm。對(duì)硝基苯酚的摩爾吸光系數(shù)為1.805×104。儀器為日立7170S自動(dòng)生化分析儀。

    3.血漿MDA測(cè)定 硫代巴比妥酸法。試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

    4.血漿GSH-Px活性測(cè)定 5',5'-二硫代雙2-硝基苯甲酸比色法。試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

    5.血漿NO及NOS測(cè)定 分別采用硝酸酶還原法及化學(xué)比色法測(cè)定血漿NO及NOS。試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

    6.血漿Hcy測(cè)定采用酶循環(huán)法。試劑盒由四川新成生物科技有限責(zé)任公司提供。

    7.血脂測(cè)定 分別采用磷酸甘油氧化酶-過(guò)氧化酶法、膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶法、清除法(一步法)及選擇性遮蔽法(一步法)測(cè)定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C);采用透射免疫濁度法測(cè)定載脂蛋白A(apo A)、載脂蛋白B(apo B)。試劑盒由浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司提供。所有生化項(xiàng)目均在日立7170S生化分析儀上完成。

    8.血漿SOD活性測(cè)定 黃嘌呤氧化酶法。試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

    9.血漿葉酸測(cè)定 離子捕獲免疫分析法。儀器和試劑均由美國(guó)雅培公司提供。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    結(jié) 果

    一、HHcy組和對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)比較

    2組的年齡和性別構(gòu)成比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HHcy組與對(duì)照組血脂、體重指數(shù)、血壓差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

    二、HHcy組與對(duì)照組血漿 PON1、GSH-Px、SOD、NOS活性及MDA、NO、葉酸水平比較

    HHcy患者血漿 PON1、SOD、GSH-Px、NOS 活性及NO水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01),血漿MDA水平則明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)表2。

    表1 HHcy組和正常對(duì)照組一般資料的比較(±s)

    表1 HHcy組和正常對(duì)照組一般資料的比較(±s)

    注:與正常對(duì)照組比較**P<0.01,*P<0.05

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    表2 HHcy組和正常對(duì)照組血漿PON1、SOD、GSH-Px、NOS活性及MDA、NO水平比較(±s)

    表2 HHcy組和正常對(duì)照組血漿PON1、SOD、GSH-Px、NOS活性及MDA、NO水平比較(±s)

    注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01

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    三、HHcy患者血漿 Hcy與PON1、GSH-Px、SOD、NOS、MDA、NOS 的相關(guān)性分析

    HHcy患者血漿 Hcy與PON1、GSH-Px、SOD、NOS、NO呈明顯負(fù)相關(guān),與MDA呈明顯正相關(guān),見(jiàn)表3。

    表3 HHcy患者血漿Hcy與PON1、GSH-Px、SOD、NOS、MDA、NO 的相關(guān)性分析

    討 論

    心腦血管疾病患病率與病死率迄今仍居高不下,已成為威脅人類健康的主要疾病之一。而動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是該類疾病重要的病理基礎(chǔ)。Hcy是體內(nèi)蛋氨酸代謝途徑中形成的一種含硫氨基酸,屬于蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。近年來(lái)大量研究證實(shí),HHcy成為繼高血脂、高血壓、糖尿病、吸煙等因素之后AS和血栓性疾病的一個(gè)新的、重要的、獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。據(jù)估計(jì)有5%~7%的普通人血中Hcy有輕至中度的增高,而40%以上確診為冠狀動(dòng)脈疾病、腦血管疾病、外周動(dòng)脈阻塞性疾病、周圍血管性疾病或反復(fù)性靜脈血栓癥的患者都伴有HHcy[5]。因此,Hcy的致病機(jī)制研究成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

    本研究結(jié)果顯示,HHcy患者血漿MDA水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01),PON1、GSH-Px、SOD、NO、NOS水平明顯降低(P<0.01),且血漿Hcy與MDA呈明顯正相關(guān)(P<0.01),與PON1、GSH-Px、MDA、SOD、NO、NOS呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01)。GSH-Px和SOD均為人體內(nèi)重要的抗氧化酶,在水解ROS的過(guò)程中逐步被消耗,使其直接參與血中脂質(zhì)過(guò)氧化物的水解的能力減弱,不能有效清除過(guò)氧化物,特別是脂質(zhì)過(guò)氧化物,使其在血中大量蓄積。本研究結(jié)果顯示HHcy患者體內(nèi)GSH-Px、SOD活性均明顯降低,提示其抗氧化能力降低。而MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化的較穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物之一,其水平升高提示脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示HHcy患者M(jìn)DA水平明顯增高,說(shuō)明其體內(nèi)存在脂質(zhì)過(guò)氧化的傾向。

    PON1是近年來(lái)頗受關(guān)注的一種抗氧化酶,與還原型谷胱甘肽(GSH)有協(xié)同抗氧化作用[6]。PON1的主要作用一是通過(guò)過(guò)氧化物酶樣作用,降解高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)中的氧化脂肪酸和氧化膽固醇,減少脂質(zhì)的過(guò)氧化以抑制LDL和HDL的氧化,保護(hù)HDL的抗氧化功能和逆行轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的功能[7],抵抗低密度脂蛋白的氧化而減少氧化低密度脂蛋白的生成;二是降解Hcy的代謝產(chǎn)物硫內(nèi)酯,以減少其致動(dòng)脈粥樣硬化作用[8]。

    因此,HHcy患者由于種種原因使ROS產(chǎn)生過(guò)多,抗氧化酶如GSH-Px、SOD和PON1及其他抗氧化劑在與ROS的作用中消耗或抗氧化酶產(chǎn)生減少,導(dǎo)致抗氧化酶及其他抗氧化劑不同程度下降,不能清除體內(nèi)過(guò)多的ROS,氧化與抗氧化失衡,大量的ROS在體內(nèi)蓄積,可能通過(guò)多種機(jī)制參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

    導(dǎo)致HHcy患者氧化應(yīng)激增強(qiáng)的因素還不完全清楚,可能與下列因素有關(guān):第一,Hcy含自由巰基,在金屬離子(Fe3+和Cu2+)的存在下,可以自身氧化成同型胱氨酸、Hcy混合性二硫化物和Hcy硫內(nèi)酯,同時(shí)產(chǎn)生H2O2、羥自由基(OH·)和超氧陰離以加劇LDL的氧化反應(yīng),形成ox-LDL,從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[9]。另外,Hcy抑制前列環(huán)素的合成,在黃嘌呤氧化酶催化的氧化反應(yīng)及花生四烯酸代謝途徑中產(chǎn)生的大量自由基、過(guò)氧化物及其他有高度活性的物質(zhì)都參與了Hcy對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。第二,Hcy抑制抗氧化酶活性。H2O2生成后可自由地穿透細(xì)胞膜,迅速被GSH-Px還原生成H2O。研究顯示,Hcy可以降低內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)的GSH-Px的mRNA水平,并抑制酶的活性,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化機(jī)制受損,并加強(qiáng)了超氧自由基介導(dǎo)的NO滅活作用[10]。SOD是超氧離子歧化的必需催化酶,具有保護(hù)細(xì)胞不受氧自由基損害的作用。Hcy可抑制其表達(dá)和分泌,導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用減弱。第三,Hcy對(duì)NO的影響。Hcy氧化過(guò)程中產(chǎn)生的H2O2、,可使NO氧化生成過(guò)氧亞硝基(ONOO-),使NO失去生物活性。當(dāng)HHcy時(shí),Hcy長(zhǎng)期作用于內(nèi)皮細(xì)胞使得NOS受損,NOS基因表達(dá)減少,NO合成減少。由于NO相對(duì)缺乏,S-亞硝基-同型半胱氨酸(S-NO-Hcy)生成減少,導(dǎo)致未被NO結(jié)合的游離Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞,而受損的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO更少,形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死[11]。此外,Hcy通過(guò)增加NOS抑制劑非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)的生成,而降低內(nèi)皮細(xì)胞釋放 NO[12]。

    本研究結(jié)果只針對(duì)單純HHcy患者氧化與抗氧化指標(biāo)的變化,而以前多集中于HHcy合并糖尿病、腦梗死等患者中氧化與抗氧化指標(biāo)的變化的研究,其結(jié)果基本一致,說(shuō)明HHcy患者無(wú)論有無(wú)臨床表現(xiàn),其氧化與抗氧化已失衡,尤其是單純HHcy患者其氧化與抗氧化指標(biāo)已發(fā)生明顯變化,應(yīng)引起臨床高度重視。

    綜上所述,HHcy患者ROS產(chǎn)生增加,機(jī)體的抗氧化酶在清除ROS時(shí)其活性降低,導(dǎo)致抗氧化能力下降,使體內(nèi)氧化與抗氧化處于不平衡狀態(tài),產(chǎn)生氧化應(yīng)激,通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。因此,有必要關(guān)注HHcy患者體內(nèi)氧化與抗氧化狀態(tài)。

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