血清游離脂肪酸酶法測定的方法學(xué)評(píng)價(jià)及生物學(xué)變異研究

鹿 剛， 高社軍， 巨英博

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊050011)

游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)又稱非酯化脂肪酸，其在血液中的濃度能反映人體脂肪代謝情況，與血脂代謝異常、胰島素抵抗、代謝綜合征以及糖尿病、心血管疾病的發(fā)病有密切關(guān)系［1-3］。以往檢測血清(或血漿)FFA多采用氣相色譜法［4］或高效液相色譜法［5］。但這些方法技術(shù)要求較為嚴(yán)格，檢測成本高。近年來發(fā)展起來的酶學(xué)比色法(簡稱酶法)具有檢測方便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)而受到臨床實(shí)驗(yàn)室青睞，目前臨床上檢測血清(或血漿)FFA多采用該方法。酶法測定原理中需要3種酶——乙酰輔酶A合成酶(acyl-CoA synthetase，ACS)、脂酰輔酶 A氧化酶(acyl-CoA oxidase，ACOD)和過氧化物酶(peroxidase，POD)。主要原理為FFA在ACS的催化下生成脂酰輔酶A，脂酰輔酶A在ACOD的催化下產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫在POD存在下作用于相應(yīng)底物產(chǎn)生有色的醌類物質(zhì)，其吸光度的大小與FFA的濃度成正比。

檢驗(yàn)項(xiàng)目的生物學(xué)變異具體可分為個(gè)體間生物學(xué)變異(between-subject or inter-individual biological variation)和個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異(withinsubject or intra-individual biological variation)，兩者的大小常用變異系數(shù)(CV)表示，分別用符號(hào)CVG、CVI(或 CVg、CVW)表示，主要用于制定臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量規(guī)范，同一患者系列結(jié)果的解釋及臨床課題的科研設(shè)計(jì)等。

我們采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)EP5-A2和EP15-A文件中描述的方法評(píng)價(jià)了酶法測定FFA的精密度和正確度，并以13名健康青年志愿者為研究對(duì)象，在6周時(shí)間內(nèi)每2周測定1次血清FFA濃度，計(jì)算個(gè)體間及個(gè)體內(nèi)的生物學(xué)變異大小。

材料和方法

一、對(duì)象

選擇13名志愿者，男3名，女10名，年齡21～23歲，平均年齡為21.8歲，體質(zhì)指數(shù)(BMI)為18.49～26.50 kg/m2，平均為21.72 kg/m2，無心血管疾病史，無手術(shù)史，不吸煙，不飲酒。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室檢查顯示血脂類常規(guī)生化指標(biāo)均正常。本實(shí)驗(yàn)通過當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)審查，所有志愿者均簽署知情同意書。

二、方法

1.試劑和儀器 血清FFA酶法試劑盒及校準(zhǔn)品購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為12-0401P、12-0720P、13-0125P。儀器為UniCel DxC800全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，采用海爾DW-86L386超低溫冰箱(-80℃)保存樣品，采血針和真空生化采血管(含促凝劑)購自湖北金杏科技發(fā)展有限公司。

2.精密度評(píng)價(jià) 按照CLSI EP5-A2文件的精密度評(píng)價(jià)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［6］。以新鮮混合血清作為實(shí)驗(yàn)樣品，使用另一份新鮮混合血清作為質(zhì)控血清，都分裝成足夠?qū)嶒?yàn)用的小份于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。每一批測定FFA濃度(試劑批號(hào)12-0401P)時(shí)，樣品和質(zhì)控各取1份，且樣品重復(fù)測定2次，質(zhì)控測定1次。每天測定2批，間隔時(shí)間不少于2 h。連續(xù)測定20個(gè)工作日(2012年5月)，其中在前5 d結(jié)束后做初步精密度試驗(yàn)，即在同一批中重復(fù)測定樣品20次，根據(jù)EP5-A2文件中方法判斷有無失控批，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)每批的質(zhì)控結(jié)果判斷有無失控批，如有則去除該日結(jié)果，繼續(xù)測夠20 d。實(shí)驗(yàn)完成時(shí)共得到80個(gè)樣品測量結(jié)果，根據(jù)該結(jié)果計(jì)算批內(nèi)、批間、日間和室內(nèi)不精密度。

3.正確度評(píng)價(jià) 按照CLSI EP15-A文件的正確度評(píng)價(jià)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［6］。測定上海市臨床檢驗(yàn)中心提供的3個(gè)濃度水平的血清FFA室間質(zhì)評(píng)樣品(試劑批號(hào):13-0125P)，測定過程中同時(shí)做室內(nèi)質(zhì)控，保證測定時(shí)未失控，將測定結(jié)果與相應(yīng)的靶值比較計(jì)算偏差。

4.生物學(xué)變異實(shí)驗(yàn)的樣品采集及檢測 所有參加實(shí)驗(yàn)的志愿者在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段保持正常飲食、學(xué)習(xí)和工作。采血前一天22∶00以后保持空腹直到采血完成，且不進(jìn)行強(qiáng)體力運(yùn)動(dòng)。采血時(shí)間為周五早上7∶00，在檢驗(yàn)科由一名固定的采血人員采集靜脈血4 mL，采血部位均為左上肢肘正中靜脈，使用的采血材料是采血針和真空生化采血管(含促凝劑)。樣品采集后放置30 min，2 100×g離心5 min，提取血清，保存在-80℃冰箱，直到檢測使用。實(shí)驗(yàn)過程中每名志愿者共采集4次樣品，每2次的間隔時(shí)間為2周，整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為6周(2012年11月至12月)。測定血清FFA時(shí)每名志愿者的4個(gè)樣品要在同批測定，所有樣品使用同一試劑盒(批號(hào):12-0720P)，在最短時(shí)間內(nèi)完成檢測。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.批內(nèi)(即重復(fù)性)、批間、日間和室內(nèi)不精密度(即總不精密度)的計(jì)算［6］先計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(s)，然后除以總的測量均數(shù)得到CV，用CV表示各個(gè)不精密度大小。批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差用Sr表示，公式:，在該式中及以下公式中I代表總的運(yùn)行天數(shù)(本研究中為20 d)，j為每日的批次(本研究為2批)，xij1為第i日第j批第1次的結(jié)果。批間s用Srr表示，公式第i日第1批測量結(jié)果的均值。日間s用Sdd表示第 i日結(jié)果的均值所有結(jié)果的均值。室內(nèi)s用ST表示，

2.偏差的計(jì)算［6］偏差=測量結(jié)果-靶值，百分比偏差=100%×(測量結(jié)果-靶值)/靶值。

3.個(gè)體間生物學(xué)變異(CVG)、個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異(CVI)的計(jì)算［7-8］血清FFA濃度經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后成為正態(tài)分布數(shù)據(jù)。計(jì)算個(gè)體間生物學(xué)變異的方差(VG)和個(gè)體內(nèi)變異的方差(VW)是通過SAS9.1軟件MIXED方差分析過程，把FFA濃度的對(duì)數(shù)值作為應(yīng)變量，把不同采血時(shí)間作為自變量，把實(shí)驗(yàn)對(duì)象作為隨機(jī)變量(RANDOM變量)。由于是經(jīng)過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成為正態(tài)分布，故將上步得到的相應(yīng)方差求平方根即可得到CVG和個(gè)體內(nèi)變異(CVW)值。CVW又包括CVI和分析變異(CVA)。CVI通過下列公式計(jì)算，CVI=源于上述精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中得到的批內(nèi)不精密度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、根據(jù)初步精密度試驗(yàn)和每批質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)判斷，在20 d共40批樣品測定中未出現(xiàn)失控批。樣品的FFA濃度總均值為0.796 mmol/L，批內(nèi)、批間、日間和室內(nèi)的不精密度見表1。廠商聲明的重復(fù)性為5%，總不精密度的合格標(biāo)準(zhǔn)按照室間質(zhì)量評(píng)估允許FFA誤差(25%)的1/4計(jì)算，為6.25%［9］?？梢妼?shí)驗(yàn)獲得的用戶重復(fù)性低于廠家聲明，總不精密度低于合格標(biāo)準(zhǔn)，故不需做重復(fù)性或總不精密度比較的卡方檢驗(yàn)［6］。

表1 酶法測定血清FFA的批內(nèi)、批間、日間和室內(nèi)不精密度

二、實(shí)驗(yàn)測定的室間質(zhì)評(píng)樣品血清FFA濃度經(jīng)與靶值比較得到的偏差、百分比偏差見表2。根據(jù)上海市臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)血清FFA的允許誤差(25%)判斷，實(shí)驗(yàn)測定的3個(gè)質(zhì)評(píng)樣品的偏差均在允許誤差范圍內(nèi)。正確度評(píng)價(jià)的合格標(biāo)準(zhǔn)按照室間質(zhì)量評(píng)估允許FFA誤差的1/2(12.5%)，則2號(hào)和3號(hào)質(zhì)評(píng)樣品的偏差能達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。

表2 實(shí)驗(yàn)測定室間質(zhì)評(píng)樣品的偏差和百分比偏差結(jié)果

三、生物學(xué)變異實(shí)驗(yàn)中測得的所有樣品的FFA濃度先經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，通過Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)為正態(tài)分布(P=0.458＞0.05)。血清 FFA 的 CVG、CVI和 CVA分別為8.43%、19.36%、2.15%。13名健康志愿者在6周時(shí)間內(nèi)4次測定血清FFA水平的變化情況見圖1。

圖1 13名志愿者4次測定血清FFA濃度的變化情況

討 論

臨床檢驗(yàn)診斷中應(yīng)用的常規(guī)血脂代謝指標(biāo)主要有高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)及總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、脂蛋白(a)［Lp(a)］和載脂蛋白A1(apo A1)、載脂蛋白B(apo B)等。血清FFA是新的血脂類生化代謝指標(biāo)［10］，主要來源于脂肪酶水解 TG或 TC而產(chǎn)生的脂肪酸，根據(jù)分子鏈中是否有不飽和雙鍵及不飽和雙鍵數(shù)量多少可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。酶法測定的血清FFA濃度包含有上述各種脂肪酸的總濃度。多數(shù)文獻(xiàn)已證實(shí)2型糖尿病患者血清FFA含量高于正常人［3，11-13］。FFA 參與胰島素抵抗［1］和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［2］等病理生理過程。酶法試劑盒最初從國外進(jìn)口，進(jìn)口試劑以其穩(wěn)定和優(yōu)秀的分析性能使得許多實(shí)驗(yàn)室仍在使用，但進(jìn)口試劑盒的價(jià)格昂貴，檢測成本較高。本研究選擇了國產(chǎn)酶法試劑盒，首先按CLSI EP5-A2文件和EP15-A文件中描述的方法對(duì)酶法的精密度和正確度進(jìn)行簡單評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)中獲得的重復(fù)性(2.15%)低于廠家聲明(5.00%)，同時(shí)總不精密度(5.46%)能達(dá)到公認(rèn)的合格標(biāo)準(zhǔn)(6.25%)。其中批間不精密度(3.44%)和日間不精密度(3.67%)均高于批內(nèi)不精密度(2.15%)，故批間和日間不精密度是本實(shí)驗(yàn)室總不精密度的主要來源。李義龍等［9］評(píng)價(jià)了進(jìn)口FFA酶法試劑盒的精密度，高、低兩濃度水平樣品的總不精密度分別為2.20%和3.30%，均優(yōu)于本研究中獲得的總不精密度，而他們實(shí)驗(yàn)中2個(gè)濃度樣品的總不精密度主要來源都僅是批間不精密度(2.10%和1.80%)。本研究測定了上海市臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)血清FFA項(xiàng)目的3個(gè)濃度水平的樣品，測定結(jié)果的百分比偏差從低濃度樣品到高濃度樣品依次為24.20%、-0.90%、-1.50%，均在室間質(zhì)評(píng)規(guī)定的允許誤差范圍內(nèi)。然而以此次測定室間質(zhì)評(píng)樣品的結(jié)果做正確度評(píng)價(jià)，則低濃度樣品的百分比偏差超過了正確度評(píng)價(jià)的合格標(biāo)準(zhǔn)(12.50%)，其他2個(gè)樣品的百分比偏差都能達(dá)到該合格標(biāo)準(zhǔn)。

CVI是正常人體內(nèi)被檢測物質(zhì)濃度在連續(xù)幾次測定時(shí)發(fā)生變化的重要因素。有學(xué)者認(rèn)為是人體內(nèi)的某物質(zhì)圍繞其穩(wěn)態(tài)點(diǎn)的上下波動(dòng)［14］。這種變化(或波動(dòng))大小在不同物質(zhì)間會(huì)有很大差異，也就是說不同物質(zhì)的CVI不同。目前大部分臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目的CVG和CVI都已經(jīng)有大量文獻(xiàn)可供參考，然而由于受到研究對(duì)象、樣品采集間隔時(shí)間、實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間長短等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素的影響，相同的檢驗(yàn)項(xiàng)目在不同文獻(xiàn)中報(bào)道的生物學(xué)變異大小也不一致。了解某個(gè)項(xiàng)目的生物學(xué)變異大小最簡便的方法是查看生物學(xué)變異的匯編數(shù)據(jù)庫，例如Sebastian-Gambaro等［15］發(fā)表的匯編數(shù)據(jù)庫文章、美國Westgard網(wǎng)站上 Ricos等［16］的匯編數(shù)據(jù)庫。在Westgard網(wǎng)站上不僅有各個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目的CVG、CVI值，還給出了基于生物學(xué)變異計(jì)算的各個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目的合適精密度和正確度性能指標(biāo)以及允許總誤差，這對(duì)于制定檢驗(yàn)項(xiàng)目的臨床質(zhì)量規(guī)范是非常有價(jià)值的參考依據(jù)。此外在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域基于生物學(xué)變異還能計(jì)算的指標(biāo)包括個(gè)體化指數(shù)(II)、參考變化值(RCV)、準(zhǔn)確估計(jì)穩(wěn)態(tài)點(diǎn)需要的最少測定次數(shù)等［14］。在臨床課題的科研設(shè)計(jì)中，一般認(rèn)為單次測定能反映被測物在體內(nèi)的代謝水平，可如果考慮了被測物的生物學(xué)變異，那會(huì)使所進(jìn)行的科學(xué)研究更嚴(yán)謹(jǐn)。目前關(guān)于生物學(xué)變異的統(tǒng)計(jì)處理方法尚未統(tǒng)一，不同作者所采用的方法不完全相同。早在1989年該領(lǐng)域著名的學(xué)者Fraser和Harris共同發(fā)表了臨床化學(xué)工作中開展生物學(xué)變異研究的綜述性文章［7］。以后各國學(xué)者發(fā)表的生物學(xué)變異的論文絕大多數(shù)采用他們介紹的方法［17］。在該方法中計(jì)算個(gè)體間、個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異及分析變異的方差采用嵌套設(shè)計(jì)資料的方差分析。在分析前要進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，并進(jìn)行Cochran、Reed檢驗(yàn)檢查有無離群值，如有則去除，保證在進(jìn)行方差分析時(shí)數(shù)據(jù)是正態(tài)分布且沒有異常值。應(yīng)用該方法把本研究的原始數(shù)據(jù)重新計(jì)算得到血清FFA的CVG和CVI分別為9.72%和18.84%，與本研究采用混合線性模型方差分析過程［8］得到的結(jié)果相似。相比較而言，本研究所用方法更簡便，適用性更廣。血清FFA的生物學(xué)變異研究文獻(xiàn)很少，在匯編數(shù)據(jù)庫中也未查到該項(xiàng)目。Widjaja等［8］曾報(bào)道血清 FFA的 CVG、CVI分別為32%、45%，與本研究得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有不同(CVG、CVI分別為8.43%、19.36%)。本研究的CVI值低于文獻(xiàn)報(bào)道的原因可能與樣品采集周期和研究時(shí)間長短有關(guān)，在Widjaja等［7］的研究中連續(xù)12 d每天采集健康人血樣品，而本研究測定了更長一段時(shí)期(6周)內(nèi)的CVI，結(jié)果一般會(huì)偏小。本研究CVG值也低于文獻(xiàn)報(bào)道，這可能與選擇的研究對(duì)象之間更相近有關(guān)。本研究生物學(xué)變異的計(jì)算中用到了CVW。CVW實(shí)際上是除外病理因素，包括所有能引起被檢物質(zhì)濃度變化的變異總和［8］。具體可分為分析前變異、CVA和CVI。本研究未計(jì)算分析前變異，是由于從樣品采集時(shí)間、采集部位、空腹時(shí)間及飲食運(yùn)動(dòng)狀態(tài)等到樣品離心、樣品保存條件等都有嚴(yán)格限制要求，盡量縮小分析前變異，故分析前變異成分可以忽略不計(jì)。還有在實(shí)驗(yàn)中還要求每名健康志愿者的4個(gè)樣品在同一批測定，為了是在計(jì)算中用到的分析變異大小可以等同于批內(nèi)不精密度大小。

本研究的不足和局限性在于:第一，CLSI EP5-A2精密度評(píng)價(jià)文件常用于自建檢驗(yàn)系統(tǒng)精密度的確立，并推薦使用2個(gè)濃度水平的實(shí)驗(yàn)樣品，盡可能選擇接近醫(yī)學(xué)決定水平的濃度，然而該文件也可用于檢驗(yàn)系統(tǒng)精密度的驗(yàn)證評(píng)價(jià)，做驗(yàn)證評(píng)價(jià)的缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)步驟及統(tǒng)計(jì)過程繁瑣、復(fù)雜。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬H是核實(shí)廠家聲明的精密度和正確度，可選擇CLSI EP15-A文件中敘述的簡便方法。為了獲得更豐富的精密度評(píng)價(jià)結(jié)果，本研究選擇了EP5-A2文件中敘述的方法，但由于實(shí)驗(yàn)條件限制簡化了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，只做了1個(gè)濃度水平的實(shí)驗(yàn)樣品。第二，正確度評(píng)價(jià)的主要方法是CLSI EP9-A文件中敘述的方法，但對(duì)于本研究評(píng)價(jià)血清FFA的正確度，很難找到所需參考方法或比較方法，也就很難按照EP9-A文件的方法去做正確度驗(yàn)證，故本研究選擇了EP15-A文件中描述的檢測權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的室間控制品的實(shí)驗(yàn)方案。這不同于測定商品化的定值質(zhì)控品，對(duì)于后者由于廠家賦值程序不同，故需謹(jǐn)慎采用。第三，因?yàn)楸狙芯孔龇椒▽W(xué)評(píng)價(jià)時(shí)選擇方法較簡單，所以實(shí)驗(yàn)中獲得的精密度和正確度僅用于本實(shí)驗(yàn)室的性能核實(shí)，具有一定的局限性，對(duì)使用該試劑盒的其他實(shí)驗(yàn)室僅供簡單參考。

本研究中使用的酶法測定FFA的精密度和正確度能滿足用戶實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量規(guī)范要求。血清FFA的CVG和CVI可為制定臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量規(guī)范、同一患者系列檢驗(yàn)結(jié)果的解釋以及臨床課題的科研設(shè)計(jì)等提供有用的參考依據(jù)。

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