固定化Colletotrichum lini ST-1轉(zhuǎn)化去氫表雄酮為三羥基雄甾烯酮*

劉梅珍，李恒，，楊春霞，吳保承，李會，龔勁松，史勁松，許正宏

1(江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

2(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇無錫，214122)

三羥基雄甾烯酮(3β，7α，15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮，7α，15α-diOH-DHEA)可合成多種甾體類激素，在醫(yī)藥工業(yè)中常作為重要的醫(yī)藥中間體［1］。但采用生物轉(zhuǎn)化法羥化去氫表雄酮(DHEA)合成三羥基雄甾烯酮的工藝，存在底物水溶性差問題，從而導(dǎo)致產(chǎn)物得率較低［2－3］。這是甾體類藥物微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)遇到的一個關(guān)鍵問題。在生產(chǎn)和研究中，已有大量方法被用于減少底物不溶解所引起的傳質(zhì)阻力。如在發(fā)酵液中直接加入表面活性劑、親水性有機(jī)溶劑或?qū)㈢摅w底物預(yù)溶于有機(jī)溶劑后再投入發(fā)酵液。然而，無論選擇哪種適用的溶劑，它們對微生物細(xì)胞的毒害作用都不可避免，這在很大程度上制約了底物投料量的增加［4－5］。如何減小溶劑對細(xì)胞的毒害作用是甾體生物轉(zhuǎn)化急需解決的難題。

固定化技術(shù)是工業(yè)生物催化領(lǐng)域的一項重要技術(shù)，具有提高催化劑的穩(wěn)定性、增加重復(fù)利用批次、并有利于提高細(xì)胞對底物和有機(jī)溶劑的耐受性以及便于產(chǎn)物的分離純化等優(yōu)勢。另外，固定化細(xì)胞容易回收重復(fù)利用，提高了單位利用率，降低了生產(chǎn)成本［6－7］。鑒于這些技術(shù)優(yōu)勢，盡管固定化操作過程會使酶活有所降低，但該技術(shù)在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域仍然備受關(guān)注。因此，選擇合適的方法和材料制備固定化細(xì)胞，以提高生物酶的保留活性、操作穩(wěn)定性以及重復(fù)利用性，并將其用于DHEA的生物轉(zhuǎn)化具有廣泛的應(yīng)用前景。據(jù)已有文獻(xiàn)資料，迄今為止，未見任何有關(guān)固定化亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum lini)ST-1并用于生物轉(zhuǎn)化DHEA生成7α，15α-diOHDHEA的相關(guān)文獻(xiàn)報道。此文通過C.lini ST-1固定化方法和材料的選擇，進(jìn)行了 C.lini ST-1轉(zhuǎn)化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA的固定化條件和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化以及批次轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 材料和設(shè)備

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

Colletotrichum lini ST-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.6051。

種子培養(yǎng)基(g/L):酵母粉15，葡萄糖15，玉米漿3，豆餅粉10，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，酵母膏15，玉米漿3，pH自然。

1.1.2 試劑

DHEA與7α，15α-diOH-DHEA 由浙江仙居藥業(yè)提供;瓊脂、瓊脂糖、卡拉膠、明膠、聚乙烯醇(PVC)、SA、CaCl2、NaCl、NaH2PO4、乙酸乙酯等均為分析或化學(xué)純，乙腈為色譜級，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要設(shè)備

硅膠層析板、層析缸、恒流泵等;恒溫混勻儀MS-100，杭州奧盛儀器有限公司;85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;日立冷凍高速離心機(jī)CR22GⅡ;戴安Ultimate3000液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體的制備與收集

菌球制備與收集:調(diào)配不同的發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值，以及添加不同濃度的吐溫－80，滅菌后按不同的接種量接種 C.lini ST-1種子液，于30℃、220 r/min搖床上培養(yǎng)24 h。得到的菌球直徑均一的菌液，洗滌過濾便得干凈菌球。

菌液制備與收集:通過控制接種量、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH及添加玻璃珠等方法培養(yǎng)菌體，獲得在0.5 mm尺度內(nèi)均一的菌液后，洗滌并離心收集得到濕菌體。

1.2.2 固定化C.lini ST-1的制備

交聯(lián):干凈菌球分別用體積分?jǐn)?shù)為0.01%的戊二醛和京尼平固定1 min后過濾洗滌，備用。

瓊脂、瓊脂糖、卡拉膠、PVC包埋:按參考文獻(xiàn)［8］制備，其中瓊脂、瓊脂糖、卡拉膠、KCl濃度均為40 g/L，PVC 濃度為140 g/L。

明膠包埋:濕菌體與等體積的40 g/L明膠溶液混合均勻后，倒在平板中。4℃冷卻凝固后，切成邊長2 mm的小塊，于1%的戊二醛溶液中浸泡30 min，傾去戊二醛，洗滌數(shù)次后4℃儲存?zhèn)溆茫?］。

SA包埋:SA溶液與濕菌體等體積混合均勻，用恒流泵使混合物通過針頭擠壓制得固定化小球(d=3 mm)于緩慢攪拌的冰浴CaCl2溶液中。4℃固定3 h后，洗滌并過濾小球，于4℃儲存在PBS溶液(10 mmol/L，pH 6.5)中備用［10－12］。

1.2.3 固定化C.lini ST-1的DHEA轉(zhuǎn)化

C.lini ST-1的固定化條件優(yōu)化:取一定量不同濃度SA(或CaCl2)制備得到的固定化C.lini ST-1于250 mL搖瓶中，加入20 mL緩沖液，投入8 g/L(研究底物濃度與批次轉(zhuǎn)化對固定化細(xì)胞的影響時另定)DHEA，于搖床上轉(zhuǎn)化。

固定化C.lini ST-1轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化:采用單因素優(yōu)化方法，保持其他轉(zhuǎn)化條件不變，僅改變搖床轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)化溫度、緩沖液pH或濃度、固定化細(xì)胞量，以及添加合適濃度金屬離子、助溶劑和不同濃度的DHEA，考察其對固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化 DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA的影響。

固定化C.lini ST-1的批次轉(zhuǎn)化:分別投加不同濃度DHEA的轉(zhuǎn)化體系，于最適條件下分別轉(zhuǎn)化最佳時長后，過濾分離固定化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化液。轉(zhuǎn)化液用于檢測產(chǎn)物的含量，固定化細(xì)胞則投入新的轉(zhuǎn)化體系中轉(zhuǎn)化。如此讓固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化5～7個批次。

底物、產(chǎn)物的含量檢測:按照參考文獻(xiàn)［13］制備HPLC樣品。HPLC條件與參考文獻(xiàn)［14］相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌球與菌液的制備

本研究初步考慮采用交聯(lián)法和包埋法2種方法來考察其對C.lini ST-1的固定情況。C.lini ST-1在普通液體培養(yǎng)條件下，菌體自成球，最終形成含有大量顆粒的菌液(圖1-a)。而本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在初始pH為4，添加10 g/L吐溫－80的條件下，可獲得直徑合適(d=2 mm)的菌球(圖1-b)，且菌球表面為毛絨狀，生理狀態(tài)良好。而添加適量玻璃珠可培養(yǎng)得到分散均勻的菌液(圖1-c)。

圖1 不同培養(yǎng)條件下的菌體形態(tài)Fig.1 Mycelial morphology under different culture conditions

2.2 交聯(lián)法

交聯(lián)劑戊二醛和京尼平交后的菌球，產(chǎn)物7α，15α-diOH-DHEA的得率分別為23.8%，6.2%，均低于對照(27.0%)。其中以京尼平為交聯(lián)劑時，固定的菌體產(chǎn)物得率大幅度下降。

隨后對戊二醛的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)交聯(lián)固定后的菌體，產(chǎn)物的得率隨著戊二醛濃度(0，0.01%，0.04%，0.07%，0.1%)的增加而迅速下降，且在第2批次轉(zhuǎn)化時菌體已基本無轉(zhuǎn)化能力。推測這可能是由于交聯(lián)劑對菌絲體的毒害作用較大。因此隨后考慮選用其他固定化方法，如包埋法。

2.3 包埋法

2.3.1 包埋材料對產(chǎn)物得率的影響

不同包埋材料制得的固定化C.lini ST-1，轉(zhuǎn)化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA的結(jié)果如圖2所示。瓊脂糖和SA包埋的C.lini ST-1，產(chǎn)物得率明顯高于其他幾種材料，且與游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力基本持平。但考慮到瓊脂糖價格貴、制得的固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度不高，而SA無此缺點。因此，最終選取SA作為包埋材料。

圖2 不同包埋材料固定化細(xì)胞的產(chǎn)物得率比較Fig.2 The product yield of immobilized cells embedded in different materials

2.3.2 SA濃度對產(chǎn)物得率的影響

包埋劑SA的濃度是影響固定化細(xì)胞活力的重要因素之一。從圖3-a可以看出，隨SA濃度的提高，7α，15α-diOH-DHEA的產(chǎn)率有一定的提高;但當(dāng) SA濃度過高時，產(chǎn)率有一定下降，這可能是SA濃度越高，雖然固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度增加，但傳質(zhì)受到相應(yīng)阻礙。最終，選取30 g/L的SA作為后續(xù)研究。

2.3.3 CaCl2濃度對產(chǎn)物得率的影響

固定劑濃度是影響固定化細(xì)胞性能的另一個重要因素。在SA濃度為30 g/L的條件下，分別用不同濃度的 CaCl2溶液固化細(xì)胞，并將其用于轉(zhuǎn)化DHEA。實驗結(jié)果如圖3-b，CaCl2濃度對產(chǎn)物的得率影響較大，當(dāng)CaCl2濃度為50 g/L時效果最佳。

圖3 SA和CaCl2濃度對產(chǎn)物得率的影響Fig.3 Effects of SA and CaCl2concentration onproduct yield

2.4 轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)速對產(chǎn)物得率的影響

用上述優(yōu)化的固定化條件制備得到的固定化C.lini ST-1，考察了轉(zhuǎn)化溫度和搖床轉(zhuǎn)速對其轉(zhuǎn)化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA的影響。由圖4可以看出，27℃時產(chǎn)物得率達(dá)到最高水平，因此轉(zhuǎn)化溫度選為27℃。對于轉(zhuǎn)速，產(chǎn)物得率在180 r/min(38.9%)時較 160 r/min(29.0%)和 220 r/min(26.0%)時高，因此最終選擇180 r/min作為后續(xù)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)速。

圖4 轉(zhuǎn)化溫度對產(chǎn)物得率的影響Fig.4 Effect of conversion temperature on product yield

2.5 緩沖液pH和濃度對產(chǎn)物得率的影響

從圖5可以看出，在pH 5～8的范圍內(nèi)，pH對固定化細(xì)胞的產(chǎn)物得率無顯著影響，為此，后續(xù)實驗將pH選為6.5。隨后本研究還測定了不同濃度磷酸鈉緩沖液對轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，緩沖液濃度為20 mmol/L時，固定化細(xì)胞的產(chǎn)物得率相對較高。

圖5 緩沖液pH對產(chǎn)物得率的影響Fig.5 Effect of buffer pH on product yield

2.6 固定化細(xì)胞量的優(yōu)化

轉(zhuǎn)化過程中所采用的固定化細(xì)胞量，影響整個體系對DHEA的轉(zhuǎn)化能力。本實驗考查了20 mL緩沖液體系中，固定化細(xì)胞添加量對產(chǎn)物得率的影響。由圖6可以看出，當(dāng)固定化細(xì)胞質(zhì)量為12 g時，產(chǎn)物得率達(dá)到最大值，約為52%。

圖6 固定化細(xì)胞量對產(chǎn)物得率的影響Fig.6 Effect of immobilized cell amount on the product yield

2.7 金屬離子對固定化C.lini ST-1轉(zhuǎn)化DHEA的影響

考慮到甾體化合物的生物羥化反應(yīng)需要Fe2+與Fe3+的循環(huán)參與［15］，所以本實驗研究了幾種常用的金屬離子對固定化C.lini ST-1轉(zhuǎn)化DHEA的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)e2+對轉(zhuǎn)化產(chǎn)率表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，其次是Zn2+，而Fe3+則具有一定的抑制效果(圖7-a)。據(jù)文獻(xiàn)報道，F(xiàn)e2+生物利用性要高于Fe3+，而且還可與超氧陰離子、過氧化氫等氧化因子反應(yīng)生成反應(yīng)性更強(qiáng)的羥基自由基，而Fe3+對菌體活力有顯著的抑制作用［16］。另外發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+在11 mmol/L時，產(chǎn)物得率達(dá)到最高值57.5%(圖7-b)。

圖7 金屬離子對產(chǎn)物得率的影響Fig.7 Effect of metal ion on product yield

2.8 助溶劑對固定化C.lini ST-1轉(zhuǎn)化DHEA的影響

親水性的醇類以及其他有機(jī)溶劑和表面活性劑，有利于增加甾體化合物的溶解性和改變生物催化劑的選擇性［4］。在本實驗考察的幾種溶劑中，丙三醇對固定化細(xì)胞的產(chǎn)物得率最為有利(圖8-a)。其后繼續(xù)考察了不同丙三醇濃度對固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化DHEA的影響，如圖8-b所示，在添加量為90 g/L時，產(chǎn)物得率為66.0%，較對照提高幅度為14.9%。

2.9 PEG對固定化C.lini ST-1轉(zhuǎn)化DHEA的影響

溶質(zhì)排出法［17］是一種有效的通過造孔而增加傳質(zhì)的方法。聚乙二醇(PEG)具有兩親性，可以作為SA固定化小球的致孔劑，且不同分子質(zhì)量的PEG可以制得不同直徑的小孔［18］。因此，在本實驗中我們選取了PEG作為制孔劑以考察其對固定化細(xì)胞產(chǎn)物得率的影響。

由圖9-a可知，PEG400制孔的固定化細(xì)胞在轉(zhuǎn)化得率上表現(xiàn)一定優(yōu)勢，而其他分子質(zhì)量的PEG化合物并無顯著影響;尤其分子質(zhì)量超過400時產(chǎn)率開始逐步下降。分析原因可能為PEG400的分子質(zhì)量比底物DHEA(分子質(zhì)量288)和產(chǎn)物7α，15α-diOHDHEA(分子質(zhì)量320)的分子質(zhì)量大且最為接近，因

圖8 助溶劑對產(chǎn)物得率的影響Fig.8 Effect of co-solvent on product yield

圖9 PEG對產(chǎn)物得率的影響Fig.9 Effect of PEG on product yield

2.10 不同底物添加量下轉(zhuǎn)化時間對產(chǎn)物得率的影響

底物對菌體有一定的毒害作用，如何選取合適的底物濃度以獲得最大產(chǎn)物得率是實際生產(chǎn)中需要考慮的重要問題。另外，底物的濃度不同，轉(zhuǎn)化體系的得率與生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最大值所需的時長不同。所以接下來考察了不同底物添加量下轉(zhuǎn)化時間對產(chǎn)物得率的影響。由圖10-a可以看出，不同的底物濃度下，得率均隨時間的增加而增加，最后基本趨于平穩(wěn)，但達(dá)到最高值所需時間不同。DHEA質(zhì)量濃度為6、8、10、12、14 g/L時固定化細(xì)胞得率達(dá)到最高值所需時間分別為:80 h(63.7%)、88 h(71.2%)、88 h(73.1%)、80 h(68.5%)和 80 h(61.1%)。而游離細(xì)胞在DHEA質(zhì)量濃度為8、10 g/L時，均為64 h(48.3%，42.3%)。同時可以看出，DHEA在10 g/L內(nèi)，隨著濃度的增加，固定化細(xì)胞的最大得率逐漸增加。但繼續(xù)加大底物濃度，菌體轉(zhuǎn)化DHEA生成目標(biāo)產(chǎn)物的能力達(dá)到極限，且底物濃度越高，對菌體的毒害越大，從而最大得率降低［18］。

圖10 不同底物投料濃度下轉(zhuǎn)化時間對產(chǎn)物得率的影響Fig.10 Effects of time on product yield at different DHEA concentration

而體系的生產(chǎn)強(qiáng)度，則都是先增加，在達(dá)到一個極值后開始下降。因為在轉(zhuǎn)化初期，固定化細(xì)胞存在傳質(zhì)阻力，所以生產(chǎn)強(qiáng)度偏低。隨著時間的延長，這種限制逐漸減除，生產(chǎn)強(qiáng)度也相應(yīng)升高;后期則因產(chǎn)物的反饋抑制而下降。不同的底物投料濃度，所得極值不同，取得極值的時間點也不同。其中，底物為6、8 g/L時，生產(chǎn)強(qiáng)度均在40 h達(dá)到最高值，10 g/L為48 h，12 g/L 為64 h，14 g/L 為72 h(圖10-b)。

2.11 批次轉(zhuǎn)化

為此，本研究又進(jìn)行了不同底物濃度下的批次轉(zhuǎn)化實驗，每批次的轉(zhuǎn)化時長為相應(yīng)底物濃度下體系的生產(chǎn)強(qiáng)度取得最高值時的時長。由表1可知，隨著固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化批次的增加，產(chǎn)物的得率先增加后下降，第2批次時最高。固定化細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)期后，以及第1批次轉(zhuǎn)化時殘留在SA小球中的產(chǎn)物的釋放，使得第2批次的產(chǎn)物得率增加。而隨后則因為固定化細(xì)胞的衰亡和營養(yǎng)物質(zhì)的缺失，得率隨之下降。固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化4個批次，底物濃度在10 g/L時最佳，其產(chǎn)能為1.09(g產(chǎn)物/g細(xì)胞)，是游離細(xì)胞0.37(g產(chǎn)物/g細(xì)胞)的3倍，且每批次得率均在42%以上，產(chǎn)量為24.1 g/L。該數(shù)據(jù)為Romanoa等人所報道產(chǎn)量的 4 倍［19］。

表1 不同底物投料濃度下的批次轉(zhuǎn)化Table 1 Batch conversion at different substrate feeding concentration

3 結(jié)論

經(jīng)過方法和材料的篩選，選擇了適用、易操作的SA包埋法。通過固定化條件和固定化C.lini ST-1轉(zhuǎn)化 DHEA生成 7α，15α-diOH-DHEA的條件的優(yōu)化，得到最適的轉(zhuǎn)化條件。投加8 g/L DHEA，在最適條件下轉(zhuǎn)化65 h，產(chǎn)物得率為68.7%，較游離細(xì)胞(51.2%)提高34.2%。而在DHEA濃度為10 g/L時，產(chǎn)物得率高達(dá)73.1%，較游離細(xì)胞(42.3%)高72.8%。說明固定化細(xì)胞在一定程度上可以有效保護(hù)菌體，提高細(xì)胞對底物的耐受性。而且固定化細(xì)胞可重復(fù)利用4個批次，生產(chǎn)力為游離細(xì)胞的3倍。

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