冷藏對(duì)藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁組分及其降解酶活性的影響*

紀(jì)淑娟，卜鳳雅，周倩，張春蕾，程順昌

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽，110866)

藍(lán)莓又名越橘，為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)，小漿果類，果實(shí)呈藍(lán)色，色澤明亮，果肉細(xì)膩，種子極小，香氣獨(dú)特，富含花色苷、黃酮、SOD等多種生理活性成分，具有極強(qiáng)的抗氧化性和保健功能，是國際糧農(nóng)組織列出的人類五大健康食品之一，被譽(yù)為“漿果之王”［1-2］。藍(lán)莓果實(shí)成熟于6～8月份的高溫多濕季節(jié)，田間熱和呼吸熱較高，采后的生理代謝旺盛，導(dǎo)致藍(lán)莓果實(shí)采后品質(zhì)下降，主要表現(xiàn)為果實(shí)嚴(yán)重失水、硬度下降快、果肉變軟、易腐爛，極不耐貯藏。因此，如何控制藍(lán)莓果實(shí)采后軟化成為其在貯藏和銷售過程中亟待解決的重要問題。

冷藏是目前應(yīng)用最有效廣泛的物理保鮮技術(shù)之一，可有效緩解采后藍(lán)莓果實(shí)的腐爛變質(zhì)，但在冷藏藍(lán)莓出庫后的常溫貨架期間，果實(shí)軟化加快，蒂痕部出現(xiàn)凹陷，品質(zhì)變劣，降低了其食用品質(zhì)和商品價(jià)值，所以，研究藍(lán)莓果實(shí)軟化機(jī)理，對(duì)控制其果實(shí)的后熟軟化進(jìn)程，延長貯藏期和提高商品價(jià)值都具有重要的意義。前人研究表明，果實(shí)軟化主要是由細(xì)胞中膠層結(jié)構(gòu)的改變?cè)斐傻募?xì)胞壁降解及組分變化而引起的［3］，其中果膠物質(zhì)的變化最為顯著，在貯藏過程中不溶性的原果膠降解成可溶性的果膠和果膠酸，最終導(dǎo)致果實(shí)軟化。果實(shí)軟化與細(xì)胞壁降解酶的活性也密切相關(guān)，PE、PG、Cx和β-Gal是導(dǎo)致果實(shí)成熟軟化的主要細(xì)胞壁降解酶［4］。研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)種類的不同導(dǎo)致其在成熟軟化過程中細(xì)胞壁組分的變化和細(xì)胞壁降解酶活性的改變方面存在著很大的差異［5-7］。目前關(guān)于藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁代謝的研究鮮有報(bào)道，本文以“藍(lán)豐”藍(lán)莓果實(shí)為試材，在細(xì)胞壁組分及其降解酶活性與果實(shí)硬度相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上，研究了冷藏過程及冷藏后常溫貨架期間藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁組分及其降解酶活性的變化，以期了解冷藏對(duì)藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁代謝的影響，為藍(lán)莓果實(shí)的貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試藍(lán)莓品種為“藍(lán)豐”，于2013年7月22日采自遼寧省農(nóng)科院藍(lán)莓基地，采收當(dāng)日選取成熟度為8～9成熟、大小均勻一致和無病、蟲、傷的果實(shí)立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并在0～1℃下預(yù)冷18 h后裝入厚度為0.02 mm的聚乙烯薄膜袋中，每袋盛果200 g，一部分藍(lán)莓果實(shí)經(jīng)預(yù)冷后置于常溫下(20±3)℃進(jìn)行貯藏，每隔1天測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo);另一部分藍(lán)莓果實(shí)經(jīng)預(yù)冷后置于(0±0.5)℃下貯藏，分別在貯藏的30、60 d取出進(jìn)行常溫貨架期的觀察與測(cè)定，每隔1天測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。設(shè)3次重復(fù)。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TA.XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀，英國SMSTA公司。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 硬度

用英國產(chǎn)TA.XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定，探頭直徑為8 mm，穿越距離為7 mm，測(cè)定速度為0.5 mm/s。

1.3.2 細(xì)胞壁物質(zhì)的提取、分離及含量測(cè)定

參考 Yun Deng等和茅林春等的方法略加改進(jìn)［8-9］，分別提取水溶性果膠(WSP)，離子結(jié)合型果膠(ISP)和共價(jià)結(jié)合型果膠(CSP)，果膠含量測(cè)定采用咔唑比色法。

1.3.3 PE活性

已有研究認(rèn)為植被、覆蓋物（凋落物積雪）都會(huì)對(duì)土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生影響，從而影響溫室氣體的排放。低溫生態(tài)系統(tǒng)的溫室氣體排放是一個(gè)多因素影響的綜合效應(yīng)過程。但是某生態(tài)因子的改變對(duì)生態(tài)系統(tǒng)非生長季溫室氣體排放的影響大小，在不同的研究中存在差異[11，34]。因而，今后研究也應(yīng)運(yùn)用更多現(xiàn)代分析手段，如同位素、PLFA、DGGE等，對(duì)非生長季土壤理化性質(zhì)、微生物功能群的多樣性及其動(dòng)態(tài)變化等進(jìn)行分析[11]。這也將是今后研究工作的一個(gè)方面。

參照Hagerman等的方法［10］。以每克鮮樣每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位，單位U為0.01 OD620/(g·min)。

1.3.4 PG活性

參照Figueroa等的方法［11］。以每分鐘每克鮮樣在37℃分解多聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1 μmol的半乳糖醛酸的質(zhì)量表示，即 μg/(g·min)。

1.3.5 Cx活性

參照王亞楠等的方法［12］。以每分鐘每克鮮樣在40℃分解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個(gè)Cx活性單位，即μg/(g·min)。

1.3.6 β-Gal活性

參照Brummell等的方法［13］。以每分鐘每克鮮樣產(chǎn)生 1 μmol的對(duì)硝基苯酚物質(zhì)的量表示，即μmol/(g·min)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫自然后熟的藍(lán)莓果實(shí)硬度、細(xì)胞壁組分及其降解酶活性之間的關(guān)系

由表1可知，在常溫自然后熟的藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁組分中，果實(shí)硬度與ISP呈顯著負(fù)相關(guān)，而與CSP呈極顯著正相關(guān)，與WSP相關(guān)性不大;在藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁酶中，果實(shí)硬度與Cx和β-Gal呈極顯著負(fù)相關(guān)，與PG呈顯著負(fù)相關(guān);由表1亦可知，細(xì)胞壁組分及其相關(guān)降解酶之間也存在著密切的關(guān)系，WSP與PE、PG呈顯著正相關(guān);ISP與PG、Cx呈極顯著正相關(guān)，與β-Gal呈顯著正相關(guān);而CSP與PG、Cx呈顯著負(fù)相關(guān)，與β-Gal呈極顯著負(fù)相關(guān)，與PE相關(guān)性不大。

表1 常溫自然后熟的藍(lán)莓果實(shí)硬度、細(xì)胞壁組分及其降解酶活性之間的相關(guān)性Table1 The correlation of blueberry firmness，cell wall compositions and their metabolizing enzyme activity at room temperature

2.2 冷藏過程中藍(lán)莓果實(shí)硬度、細(xì)胞壁組分及其降解酶活性的變化

2.2.1 果實(shí)硬度變化

由圖1可知，藍(lán)莓果實(shí)的硬度隨冷藏時(shí)間的延長而逐漸降低，冷藏的前30天硬度下降緩慢，幅度小，冷藏30 d果實(shí)硬度僅下降5.2%;在冷藏的后期，藍(lán)莓果實(shí)硬度急速下降，冷藏60 d時(shí)下降了22.21%，與入庫時(shí)相比差異達(dá)顯著水平(P＜0.05)。

圖1 冷藏期間藍(lán)莓果實(shí)硬度的變化Fig.1 Changes in firmness of blueberries during cold storage

2.2.2 果實(shí)細(xì)胞壁組分的變化

圖2 冷藏期間藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁組分的變化Fig.2 Changes in cell wall components of blueberries during cold storage

由圖2可知，隨著冷藏時(shí)間的延長藍(lán)莓果實(shí)的WSP含量呈逐漸上升趨勢(shì)，尤其是在冷藏的后期WSP快速上升;與WSP相反，藍(lán)莓果實(shí)CSP含量隨冷藏時(shí)間的延長而逐漸降低，在冷藏的后期急速下降;與WSP和CSP相比，藍(lán)莓果實(shí)中ISP含量較低，在冷藏過程中變化幅度小。

2.2.3 細(xì)胞壁降解酶活性的變化

由圖3可知，在冷藏期間PE、PG和β-Gal三種酶活性均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，其中PG和β-Gal兩種酶的活性在冷藏的前30 d上升緩慢，后期出現(xiàn)突躍性變化，活性上升幅度大;Cx活性則隨著冷藏那個(gè)時(shí)間的延長呈先緩慢下降后急劇上升的變化趨勢(shì)。

圖3 冷藏期間藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁降解酶活性的變化Fig.3 Changes in cell wall-degrading enzyme activity of blueberries during cold storage

2.3 冷藏對(duì)藍(lán)莓果實(shí)常溫貨架期果實(shí)硬度、細(xì)胞壁組分及其降解酶活性的影響

2.3.1 果實(shí)硬度變化

由圖4可見，經(jīng)過冷藏的藍(lán)莓果實(shí)在常溫貨架期硬度的變化趨勢(shì)與采后常溫自然后熟果實(shí)略有不同。采后常溫自然后熟果實(shí)硬度呈勻速下降趨勢(shì);冷藏30 d的藍(lán)莓果實(shí)在常溫貨架期的前6 d，硬度下降緩慢，之后快速下降，由此可見，冷藏30 d的藍(lán)莓果實(shí)貨架期較長;冷藏60 d的藍(lán)莓果實(shí)出庫后果實(shí)硬度迅速下降，在整個(gè)常溫貨架期間硬度均顯著低于其他處理，由此可見，冷藏60 d的藍(lán)莓果實(shí)不宜在常溫下放置。

圖4 常溫貨架期藍(lán)莓果實(shí)硬度的變化Fig.4 Changes in firmness of blueberries during shelf life at room temperature

2.3.2 細(xì)胞壁組分的變化

由圖5-A可知，冷藏30 d的藍(lán)莓果實(shí)在常溫貨架期WSP含量的變化趨勢(shì)與常溫自然后熟果實(shí)相似，均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第6天達(dá)到最大值，整個(gè)常溫貨架期間，2個(gè)處理之間差異不顯著(P＞0.05);冷藏60d的藍(lán)莓果實(shí)在常溫貨架的前4 d，WSP含量上升速度快，在第4天時(shí)，與采后自然后熟的果實(shí)差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，之后上升速度趨緩，在貨架期第8天之后急速下降。由圖5-B看出，冷藏30 d的藍(lán)莓果實(shí)和采后常溫自然后熟的果實(shí)ISP含量均在常溫貨架的第2天和第8天分別出現(xiàn)最低峰和最高峰，但是，冷藏30 d果實(shí)的低峰值和高峰值均略低于采后常溫自然后熟的果實(shí);冷藏60 d的藍(lán)莓果實(shí)在出庫時(shí)ISP含量較高，在整個(gè)常溫貨架期變化幅度小。圖5-C表明，采后自然后熟的藍(lán)莓果實(shí)從貨架期第2天開始，CSP含量持續(xù)下降;而冷藏30 d的果實(shí)在常溫貨架期的前4天變化幅度很小，之后CSP含量快速下降，而且30天冷藏的果實(shí)CSP下降幅度小于常溫自然后熟的果實(shí)，由此可見，中期冷藏可在一定程度上抑制CSP的下降;冷藏60天的藍(lán)莓果實(shí)自出庫開始，CSP含量便開始迅速下降，且在整個(gè)常溫貨架期間均顯著低于其他2個(gè)處理(P＜0.05)。

圖5 常溫貨架期藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁組分的變化Fig.5 Changes in cell wall components of blueberries during shelf life at room temperature

2.3.3 細(xì)胞壁降解酶的變化

由圖6-A可知，采后常溫自然后熟的藍(lán)莓果實(shí)PE活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在貨架第4天出現(xiàn)高峰;冷藏30 d的果實(shí)PE活性極顯著受到抑制(P＜0.01)，在整個(gè)常溫貨架期變化幅度小，而且未出現(xiàn)活性高峰;冷藏60 d的果實(shí)PE活性的整體變化趨勢(shì)與采后自然后熟的果實(shí)相似，二者無顯著差異(P＞0.05)。圖6-B表明，冷藏30 d的藍(lán)莓果實(shí)與采后常溫自然后熟果實(shí)的PG活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，但是，冷藏30 d的果實(shí)PG活性高峰的出現(xiàn)推遲了2 d;冷藏60 d的藍(lán)莓果實(shí)在整個(gè)常溫貨架期間，PG活性均極顯著高于其他處理(P＜0.01)。由6-C看出，冷藏30 d的藍(lán)莓果實(shí)與采后自然后熟的果實(shí)Cx活性均在貨架期前8天持續(xù)升高，至第8天時(shí)出現(xiàn)高峰，但是，冷藏30 d的藍(lán)莓果實(shí)Cx活性高峰值極顯著低于采后自然后熟的果實(shí)(P＜0.01);冷藏60 d的藍(lán)莓果實(shí)在常溫貨架期間Cx活性高峰提前，而且，整個(gè)貨架期間極顯著的高于采后自然后熟的果實(shí)(P＜0.01)。由此可見，適當(dāng)冷藏可有效抑制藍(lán)莓果實(shí)在常溫貨架期間Cx的活性;由圖6-D可知，3個(gè)處理的藍(lán)莓果實(shí)均呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，但是，冷藏30 d的果實(shí)在整個(gè)常溫貨架期間β-Gal活性變化幅度小，且活性始終處于較低的水平，冷藏60 d的果實(shí)β-Gal活性始終極顯著高于其他2個(gè)處理(P＜0.01)。

圖6 常溫貨架期藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁降解酶活性的變化Fig.6 Changes in cell wall-degrading enzyme activity of blueberries during shelf life at room temperature

3 結(jié)論與討論

果實(shí)軟化是果實(shí)成熟的重要特征之一，果實(shí)質(zhì)地變軟與果實(shí)細(xì)胞壁組分及其降解酶活性的變化有著密切的關(guān)系。研究結(jié)果表明，藍(lán)莓果實(shí)硬度與ISP含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與CSP含量呈極顯著正相關(guān)，這與魏建梅等在京白梨的研究中結(jié)果相似［7］，貯藏期間，ISP含量升高，CSP含量急速下降引起藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞中膠層結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)喪失以及細(xì)胞壁物質(zhì)大量分解導(dǎo)致了其硬度快速下降;果實(shí)硬度與PG活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與Cx活性和β-Gal活性呈顯著負(fù)相關(guān)，本試驗(yàn)結(jié)果中PE、PG活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，且PG活性高峰出現(xiàn)時(shí)間較PE晚2 d，這與趙云峰等在茄子的研究中結(jié)果相似［14］，這可能是由于PE的作用是去除果膠分子鏈上的半乳糖醛酸羧基上的酯化基團(tuán)，為PG提供合適的作用底物，進(jìn)而 使PG沿多聚半乳糖醛酸主鏈水解果膠酸，導(dǎo)致果膠降解，PE并沒有直接參與果膠分子的降解過程，Cx活性的上升引起纖維素的解聚從而導(dǎo)致細(xì)胞壁解體，果實(shí)硬度下降，β-Gal可以降解果膠中的半乳聚糖，使細(xì)胞壁組分不穩(wěn)定［15］，導(dǎo)致果實(shí)軟化，Cross等在西紅柿的研究中發(fā)現(xiàn)，β-Gal在果實(shí)成熟的早期先于PG出現(xiàn)［16］，本研究結(jié)果表明，β-Gal活性在藍(lán)莓果實(shí)采后自然后熟的前4天，上升速度快，幅度大，由此推測(cè)，β-Gal可能在藍(lán)莓果實(shí)軟化的初期起重要作用。由此可知，藍(lán)莓果實(shí)的軟化與ISP含量、CSP含量、PG活性、Cx活性和β-Gal活性關(guān)系密切。

冷藏期間，隨著藍(lán)莓果實(shí)硬度的下降，CSP含量逐漸上升，尤其是在貯藏后期上升速度快，而ISP含量低，變化幅度較小;PG活性和β-Gal活性在冷藏期間均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，Cx活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，3種酶的活性均在冷藏的后期急劇上升，可能由于三者的協(xié)同作用加劇了冷藏后期藍(lán)莓果實(shí)的軟化現(xiàn)象。冷藏的前30天，果實(shí)細(xì)胞壁降解酶活性變化緩慢，果實(shí)硬度保持良好;隨著冷藏時(shí)間的延長，細(xì)胞壁降解酶活性突躍性上升，CSP含量大幅下降，WSP含量快速增加，藍(lán)莓果實(shí)的硬度快速下降。冷藏30 d的藍(lán)莓果實(shí)在常溫貨架期間CSP含量變化幅度較小，PE、PG、Cx、β-Gal活性變化幅度小，且始終處于較低水平，尤其是PE和Cx活性極顯著降低，PE未出現(xiàn)活性高峰。由此可見，冷藏30 d可一定程度抑制藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞壁組分含量及其相關(guān)酶活性的變化，較好地保持果實(shí)的商品性。

［1］ 朱麟，凌建剛.國內(nèi)外藍(lán)莓保鮮技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(11):173-176.

［2］ 亦菲.藍(lán)莓，漿果之王的傳奇［J］.食品與藥品，2010，12(8):10-11.

［3］ Luis F Goulao，Cristina M Oliveira.Cell wall modifications during fruit ripening:when a fruit is not the fruit［J］.Trends in Food Science＆Technology，2008，1(19):4-25.

［4］ 程杰山，沈火林，孫秀波，等.果實(shí)成熟軟化過程中主要相關(guān)酶作用的研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2008(1):49-52.

［5］ Brummell D A，Cin V D，Crisosto C H，et al.Cell wall metabolism during the development of chillg injury in coldstored peach fruit:assocition of mealiness with arrested disassembly of cell wall pectins［J］.Journal of Experimental Botany，2004，55(405):2 041-2 052.

［6］ HU Lan-Ying，HU Shu-Li，WU Jun，et al.Hydrogen sulfide prolongs postharvest shelf Life of strawberry and play an antioxidative role in fruit［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60(35):8 684-8 693.

［7］ 魏建梅，馬鋒旺，關(guān)軍鋒，等.京白梨果實(shí)后熟軟化過程中細(xì)胞壁代謝及其調(diào)控［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8):2 987-2 996.

［8］ DENG Yun，WU Ying，LI Yunfei.Changes in firmness，cell wall composition and cell wall hydrolases of grapes stored in high oxygen atmospheres［J］.Food Research International，2005，38(7):769-776.

［9］ 茅林春，張上隆.間歇低溫脅迫對(duì)桃果實(shí)細(xì)胞壁代謝的影響［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2001，27(2):151-155.

［10］ Hagerman A E，Austin P J.Continuous spectrophotometric assay for plant pectin methyl esterase［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1986，34(3):440-444.

［11］ Figueroa Carlos R，Rosli Hernan G，Civello Pedro M.Changes in cell wall polysaccharides and cell wall degrading enzymes during ripening of Fragaria chiloensis and Fragaria ananassa fruits［J］.Scientia Horticulturae，2010，124(4):454-462.

［12］ 王亞楠，胡花麗，張璇，等.氣調(diào)貯藏對(duì)‘紅陽'獼猴桃果膠含量及相關(guān)酶的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，8(39):207-211.

［13］ 金昌海，水野雅史，汪志君，等.蘋果β-半乳糖苷酶對(duì)細(xì)胞壁多糖降解特性的研究［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2002，23(4):71-74.

［14］ 趙云峰，林瑜，吳玲艷.茄子果實(shí)采后軟化過程中細(xì)胞壁組分及其降解酶活性的變化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(10):212-216.

［15］ 魏建梅，馬鋒旺.蘋果果實(shí)β-Gal和LOX活性變化特性及其與果實(shí)軟化的關(guān)系［J］.園藝學(xué)報(bào)，2009，36(5):631-638.

［16］ Cross K C，Wallner S J.Degradation of cell wall polysaccharides during tomato fruit ripening［J］.Plant Physiology，1979，63(1):117-120.