依達(dá)拉奉對(duì)大鼠延髓缺血后神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及微血管的影響

朱 江， 郭 森， 趙 亮， 高燕軍， 趙淑敏， 楊振軍

腦缺血后腦組織中自由基的過度產(chǎn)生導(dǎo)致的蛋白質(zhì)及核酸的過氧化，是導(dǎo)致神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的主要因素。在腦缺血條件誘導(dǎo)下，延髓內(nèi)部微血管、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間存在相互影響。依達(dá)拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)作為自由基清除劑近年來被研究者關(guān)注。臨床研究提示N-乙酰門冬氨酸(NAA)是特異性的存活神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志，腦缺血發(fā)病初期含量急劇減少。本實(shí)驗(yàn)將依達(dá)拉奉應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，利用其清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化的藥理作用，探討自由基清除劑對(duì)大鼠延髓缺血神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及微血管的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)Wistar成年健康雄性大鼠，200～220 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。108只大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)組，缺血對(duì)照組。按時(shí)間點(diǎn)分為7 d、14 d兩個(gè)亞組，其中電鏡組每組6只，其余每個(gè)亞組12只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制備 結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎切斷，檢查無活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動(dòng)脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第一頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第1頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內(nèi)凝閉椎動(dòng)脈3～4 s，檢查無活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干預(yù)方法 假手術(shù)組只暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈，不做血管阻斷處理。實(shí)驗(yàn)組、缺血對(duì)照組均在阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈后立即開始治療。實(shí)驗(yàn)組每天腹腔注射依達(dá)拉奉二次，時(shí)間間隔12 h，每次注射計(jì)量按3 mg/kg計(jì)算，到術(shù)后7 d和14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取延髓。缺血對(duì)照組每天腹腔注射生理鹽水兩次，時(shí)間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術(shù)后7 d和14 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取延髓。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制作 應(yīng)用10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預(yù)先處理為鈍圓的針頭插入左心室內(nèi)，快速輸入溫生理鹽水(37℃)100 ml，同時(shí)用眼科剪剪破右心耳，此時(shí)血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol磷酸鹽緩沖液配成pH 7.4)灌流固定。灌流結(jié)束后取出延髓，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4 電鏡標(biāo)本的制作 將取得的標(biāo)本切成1 ×1 ×1 mm3的小塊，25%戊二醛固定4h，0.1 mol/L的PBS沖洗3次，每次5 min，1%鋨酸固定1.5 h，0.1 mol/L的 PBS漂洗 12 h，丙酮梯度脫水，Epon812浸透包埋，超薄切片，鈾鉛染色。

1.2.5 神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)及定量分析 每只大鼠取4張切片，每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，輸入醫(yī)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)(MiVnt)進(jìn)行圖像處理，計(jì)數(shù)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，取其平均值為這只大鼠的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 單寧酸-氯化鐵媒染法觀察微血管密度的變化 每只大鼠取3張切片，采用Mivnt圖像分析系統(tǒng)定量分析延髓微血管密度(microvesser density，MVD)和微血管面積比(microvesser aera density，MVA)。每張切片在100倍光鏡下選5個(gè)視野，分別計(jì)算MVD值和MVA值，取平均值作為該只大鼠延髓微血管的MVD值和MVA值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織中神經(jīng)元數(shù)量的變化 通過對(duì)7 d、14 d后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察，實(shí)驗(yàn)組及缺血對(duì)照組中神經(jīng)元的數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元減少的幅度較缺血對(duì)照組減少的幅度低。實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)元數(shù)量較缺血對(duì)照組數(shù)量增加。與假手術(shù)組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1)。

2.2 各組腦組織中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化通過對(duì)7 d、14 d后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察，實(shí)驗(yàn)組及缺血對(duì)照組中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較假手術(shù)組顯著增加。但是，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增加的程度低于缺血對(duì)照組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增加的程度。其中，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)段神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均低于缺血對(duì)照組數(shù)量。與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表2)。

2.3 各組腦組織中微血管密度(MVD)和微血管面積比(MVA)的變化 通過對(duì)7 d、14 d后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察，實(shí)驗(yàn)組及缺血對(duì)照組的微血管密度(MVD)值較假手術(shù)組均減少。實(shí)驗(yàn)組數(shù)值減少的幅度低于缺血對(duì)照組。其中，實(shí)驗(yàn)組MVD值在各時(shí)段均高于缺血對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組及缺血對(duì)照組的微血管面積比(MVA)值均低于假手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)組數(shù)值減少的程度較缺血對(duì)照組低。其中，實(shí)驗(yàn)組MVA值在各時(shí)間段均高于缺血對(duì)照組。與假手術(shù)組相比較二者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表3、表4)。

2.4 各組腦組織中組織學(xué)觀察 在假手術(shù)組中，神經(jīng)元胞體中央有大而圓的細(xì)胞核，核仁大而明顯，胞體的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、高爾基復(fù)合體等。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈規(guī)則平行排列。游離核糖體分布于其間。神經(jīng)元尼氏體豐富。線粒體膜完整，線粒體嵴清晰。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有序排列在神經(jīng)元周圍。微血管內(nèi)皮相互連續(xù)，基膜完整。缺血對(duì)照組實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)，可觀察到神經(jīng)元數(shù)量減少，核固縮、碎裂、溶解，膜結(jié)構(gòu)模糊。細(xì)胞核內(nèi)有核袋及假包涵體形成。核仁偏位，核膜內(nèi)陷。線粒體體積較前增大，質(zhì)地變空，線粒體嵴變短。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較前增加，排列緊密，核仁明顯。微血管閉塞，數(shù)量減少，膜結(jié)構(gòu)不清晰。實(shí)驗(yàn)14 d時(shí)可觀察到，神經(jīng)元數(shù)量較前進(jìn)一步減少，神經(jīng)元溶解消失，細(xì)胞器破壞明顯。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增加明顯，細(xì)胞較大，核較小。微血管數(shù)量較前有所增加。實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)元數(shù)量較缺血對(duì)照組數(shù)量多，核固縮、破裂、溶解的程度較缺血對(duì)照組程度輕。實(shí)驗(yàn)組較缺血對(duì)照組壞死區(qū)域面積小，且局部填充的膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少。實(shí)驗(yàn)組中微血管閉塞數(shù)量較缺血對(duì)照組少，血管內(nèi)皮腫脹程度低，膜結(jié)構(gòu)較清晰。

表1 各組大鼠腦組織中神經(jīng)元數(shù)量比較(χ±s)

表2 各組大鼠腦組織中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較(χ±s)

表3 各組大鼠腦組織中MVD含量的比較(χ±s)

表4 各組大鼠腦組織中MVA含量比較(χ±s)

3 討論

延髓內(nèi)部包含大量神經(jīng)元，神經(jīng)元周圍有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞填充。正常生理情況下，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管緊密結(jié)合在一起［1］。延髓中有大量神經(jīng)纖維通過，是聯(lián)系大腦、小腦、脊髓的生命中樞，因此，研究延髓缺血具有其重要性、必要性。

在延髓缺血后，出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量及微血管密度的減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加。在缺血條件下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生填充于壞死區(qū)域，從而影響到微循環(huán)，引起局部微循環(huán)障礙。進(jìn)一步加重神經(jīng)元的缺血，出現(xiàn)大量神經(jīng)元胞體凋亡。自由基在腦缺血缺氧損傷過程中起著關(guān)鍵性作用，自由基對(duì)腦組織的損害是通過和缺血缺氧腦損害級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制中的興奮性氨基酸、鈣超載等彼此重疊、相互聯(lián)系的作用使脂質(zhì)過氧化、膜功能損害、蛋白質(zhì)、DNA、RNA損害最終形成炎癥、凋亡等病理過程實(shí)現(xiàn)的［2］。目前認(rèn)為腦缺血后氧自由基增多是腦損傷加重的主要原因，依達(dá)拉奉作為一種新型自由基清除劑，抑制脂質(zhì)過氧化作用、抑制腦細(xì)胞過氧化，從而減輕腦缺血引起的組織損傷［3］，也能防止氧化性細(xì)胞損傷，減少缺血半暗帶面積，可減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損害［4］，從而抑制遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡［5］。為腦缺血損傷提供保護(hù)作用［6］。研究表明，依達(dá)拉奉有直接清除NO、羥自由基及抗氧化活性作用［7］。同時(shí)依達(dá)拉奉可減少神經(jīng)元NO合成酶和增加內(nèi)皮型NO合酶，從而保護(hù)缺血損傷的神經(jīng)元［8］。

通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，實(shí)驗(yàn)組延髓組織的神經(jīng)元減少的數(shù)量低于缺血對(duì)照組，提示依達(dá)拉奉可通過清除自由基而保護(hù)神經(jīng)元。實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增加的數(shù)量較缺血對(duì)照組數(shù)量低，實(shí)驗(yàn)組中延髓組織內(nèi)微血管密度較缺血對(duì)照組高。說明依達(dá)拉奉在延髓缺血過程中通過清除自由基，減輕了腦組織損傷。隨著時(shí)間的延長，盡管應(yīng)用依達(dá)拉奉干預(yù)治療，但神經(jīng)元數(shù)量仍在減少，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量仍有增加?？紤]依達(dá)拉奉可減輕內(nèi)源性自由基的產(chǎn)生，提示在治療上應(yīng)盡早用藥。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，延髓缺血后由于自由基產(chǎn)生，使延髓內(nèi)部微血管、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互影響，出現(xiàn)病灶局部微循環(huán)改變，出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，缺血腦組織損傷加重。依達(dá)拉奉通過清除自由基，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損害，改善了微循環(huán)障礙，發(fā)揮了對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

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