葛根素對(duì)血管性癡呆大鼠顳葉沉默信息調(diào)節(jié)因子3表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

常明則， 吳海琴， 喬 琳， 狄政莉， 王新來(lái)， 田 曄， 劉 勇

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是各種腦血管病引起的一種慢性、階梯式進(jìn)展、獲得性智能損害和認(rèn)知障礙的綜合征。VD在歐洲和美國(guó)等國(guó)家是僅次于阿爾茨海默病的第二位最常見(jiàn)的癡呆原因，發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家占全部癡呆患者的25% ～50%［1］。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(silent information regulation 2 homolog 3，SIRT3)是一種線粒體NAD依賴的去乙?；福谀芰可?、代謝、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)控制功能方面發(fā)揮重要作用［2］。葛根素是中藥葛根中的有效成分，是一種異黃酮單體。本課題組前期研究已表明葛根素對(duì)全腦缺血再灌注大鼠及慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用［3，4］。目前葛根素對(duì)慢性腦缺血保護(hù)作用的機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)以雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎慢性缺血致VD大鼠為模型，觀察葛根素對(duì)VD大鼠顳葉組織SIRT3、細(xì)胞凋亡及行為學(xué)變化的影響，探討其在改善認(rèn)知功能中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康SD(Sprague-Dawley)大鼠48只，雌雄不拘，體重200～250 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1 w，自由進(jìn)食、飲水。經(jīng)Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)初步篩選后，按隨機(jī)數(shù)字表分為3大組:假手術(shù)組、2-VO組和葛根素組，每組再根據(jù)缺血時(shí)間［血管分離暴露(阻斷)至開(kāi)胸灌注的時(shí)間］隨機(jī)分為2個(gè)亞組:4和8 w組，每亞組各8只。假手術(shù)組、2-VO組及葛根素組分別選取缺血4、8 w 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠于處死前測(cè)定學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2 藥品和試劑 葛根素注射液(2 ml:100 mg，陜西安康制藥廠提供，批號(hào):H61020589);兔抗大鼠SIRT3單克隆抗體:Santa Cruz公司，POD凋亡試劑盒及SABC試劑盒:購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 動(dòng)物模型的建立 慢性腦低灌注模型的制作參照de la Torre等采用的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性阻斷法(2-VO)進(jìn)行［5］。20% 水合氯醛 0.6 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，取頸前部正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套以1號(hào)手術(shù)線雙重結(jié)扎，逐層縫合。手術(shù)期間嚴(yán)密觀察呼吸變化。葛根素組:于術(shù)前3 d至術(shù)后1 w每天給予葛根素注射液100 mg/kg腹腔注射，手術(shù)當(dāng)天于結(jié)扎前1 h給藥;2-VO組:該組于相同的時(shí)間點(diǎn)分別給予等量生理鹽水腹腔注射，余條件同葛根素組;假手術(shù)組:該組大鼠僅分離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎。

1.4 學(xué)習(xí)記憶的測(cè)定 應(yīng)用Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)估，參照課題組方法［4］，每只大鼠于測(cè)試當(dāng)天共游迷宮10次，測(cè)定學(xué)習(xí)成績(jī);24 h后重復(fù)上述過(guò)程測(cè)定記憶成績(jī)。術(shù)后4 w及8 w 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠均于處死前再次行Y型水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。

1.5 標(biāo)本制備和檢測(cè)方法 選取雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后4、8 w 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以20%水合氯醛0.8 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，快速開(kāi)胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，用4%多聚甲醛灌注固定1 h，開(kāi)顱取腦，置于相同灌注液12 h，取顳葉腦組織依次脫水、透明、浸蠟及包埋，行5μm厚的連續(xù)切片。分別進(jìn)行SABC法SIRT3免疫組化染色及TUNEN法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其中SIRT3免疫組化染色過(guò)程中未行蘇木素核染色。在40×10倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，做TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞、SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，以“個(gè)/視野”為單位，結(jié)果取5個(gè)視野的平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件包處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，組間比較用單因方差分析，SNK-q檢驗(yàn)做兩兩比較，并應(yīng)用Correlate進(jìn)行相關(guān)性分析。取P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè) 雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎4 w組大鼠死亡3只，各組大鼠數(shù)目:假手術(shù)組8只，2-VO組7只，葛根素組6只;雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎8 w組大鼠死亡5只，各組大鼠數(shù)目:假手術(shù)組7只，2-VO組6只，葛根素組6只。缺血4 w及8 w時(shí)，與假手術(shù)組相比，2-VO組和葛根素組的大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均明顯下降(P均＜0.05)，但葛根素組在4 w及8 w 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均較2-VO組有明顯提高(P均＜0.05)(見(jiàn)表1、表2)。

2.2 細(xì)胞凋亡測(cè)定 光鏡下陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，而陰性細(xì)胞呈淡藍(lán)色。假手術(shù)組顳葉偶見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎后4 w 2-VO組與葛根素組顳葉TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P均＜0.05)，8 w時(shí)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)仍明顯多于假手術(shù)組(P均＜0.05)。在4 w和8 w時(shí)相點(diǎn)葛根素組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著少于2-VO組(P 均 ＜0.05)(見(jiàn)表3、表4)。

2.3 SIRT3表達(dá) 假手術(shù)組顳葉皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)少量SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)。大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎后4 w 2-VO組與葛根素組顳葉SIRT3呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，鏡下觀察呈顆粒狀，以胞膜染色為主，主要位于Ⅱ、Ⅲ層;持續(xù)到8 w時(shí)仍明顯高于假手術(shù)組(P均＜0.05);與2-VO組比較，葛根素組SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P均＜0.05)(見(jiàn)表3、表4)。

表1 4 w時(shí)不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)(χ±s)

表2 8 w時(shí)不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)(χ±s)

表3 4 w時(shí)不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的SIRT3及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(χ±s)

χ±s)表4 8 w時(shí)不同實(shí)驗(yàn)組大鼠的SIRT3及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(

2.4 SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與凋亡細(xì)胞的關(guān)系 對(duì)2-VO組及葛根素組顳葉的SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與凋亡細(xì)胞數(shù)做相關(guān)分析表明:2-VO組SIRT3與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在 4、8 w呈負(fù)相關(guān)(r=-0.809，P=0.028)(r=-0.893，P=0.017);葛根素組 SIRT3與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在4、8 w呈負(fù)相關(guān)(r=-0.968，P=0.001)(r=-0.866，P=0.026)。

3 討論

關(guān)于SIRT3在腦缺血病理生理過(guò)程的研究迄今為止鮮有報(bào)道。去乙酰化酶sirtuins通過(guò)對(duì)廣泛的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行去乙?；刃揎梾⑴c基因沉默、DNA雙鏈斷裂修復(fù)、組蛋白去乙酰化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、能量代謝和抗衰老等重要的生命過(guò)程。顳葉病變患者主要臨床表現(xiàn)為人格、情感和行為改變以及言語(yǔ)障礙，早期人際交往能力下降，表現(xiàn)為不遵循社會(huì)行為規(guī)范，脫抑制;后期出現(xiàn)空間定向力和記憶力受損，因此推測(cè)顳葉受累在血管性癡呆發(fā)病過(guò)程中極為重要。本研究擬評(píng)價(jià)葛根素對(duì)大鼠VD模型顳葉SIRT3表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，探討其改善VD學(xué)習(xí)記憶障礙的可能機(jī)制。結(jié)果表明，VD大鼠顳葉皮層SIRT3表達(dá)上調(diào)，提示慢性腦缺血缺氧可能誘導(dǎo)顳葉皮層區(qū)SIRT3;而葛根素干預(yù)可能通過(guò)上調(diào)SIRT3減輕顳葉皮層細(xì)胞凋亡，從而改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

生物膜漸進(jìn)性損傷是慢性腦缺血病理生理過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，線粒體氧化應(yīng)激過(guò)程導(dǎo)致細(xì)胞骨架嚴(yán)重破壞，干擾細(xì)胞能量代謝，參與微循環(huán)障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血腦屏障破壞等一系列病理生理過(guò)程。SIRT3是sirtuin家族中的重要一員，在調(diào)控線粒體能量代謝過(guò)程中具有重要的作用。SIRT3依賴SOD2減少細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，降低線粒體膜電位，增強(qiáng)細(xì)胞的呼吸作用，調(diào)節(jié)線粒體功能，增強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性及抗氧化活性，抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。SIRT3是調(diào)節(jié)線粒體ROS代謝通路的樞紐［6～8］。在體外培養(yǎng)條件下，sirtuin抑制劑導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平提高，抗氧化劑和低氧刺激均可恢復(fù)這種效應(yīng)。這些與線粒體能量代謝有關(guān)的效應(yīng)可被RNA干擾敲除SIRT3的實(shí)驗(yàn)，以及白藜蘆醇防護(hù)過(guò)氧化氫對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷與激活 SIRT1、SIRT3、SIRT4和SIRT7從而產(chǎn)生抗凋亡作用的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)［9］。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血應(yīng)激等某些特殊條件下，SIRT3可以脫離線粒體入核［10］。線粒體通過(guò)多種途徑參與腦缺血后神經(jīng)元損傷過(guò)程，SIRT3可能通過(guò)干預(yù)包括生成過(guò)量的活性氧造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷以及膜完整性破壞影響生物活性物質(zhì)釋放等病理機(jī)制，抑制內(nèi)源性及外源性細(xì)胞凋亡的部分通路。

我們推測(cè)，葛根素可能通過(guò)促進(jìn)SIRT3表達(dá)上調(diào)和錳超氧化物歧化酶的表達(dá)減少、刺激環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化和上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體輔激活因子表達(dá)，減少ROS的生成，抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究中對(duì)SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果表明，SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，即隨著SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，間接印證了SIRT3可能參與慢性腦缺血后抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了葛根素減輕VD大鼠學(xué)習(xí)記憶損害機(jī)制可能與誘導(dǎo)上調(diào)顳葉SIRT3蛋白表達(dá)和抗凋亡有關(guān)，為臨床使用SIRT3激活劑治療VD提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也間接推測(cè)葛根素作為中藥制劑可能為SIRT3天然激動(dòng)劑。然而，SIRT3在腦缺血病理生理中的具體作用、葛根素如何啟動(dòng)SIRT3表達(dá)及SIRT3參與抗凋亡的具體分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。

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