脂聯(lián)素基因多態(tài)性(-11377 C/G，-3964A/G，-45T/G)與腦梗死相關(guān)性研究

相 波， 丁曉潔， 張 磊， 王 超， 王曉青， 潘旭東

脂聯(lián)素(Adiponectin，ADIPOQ)是由脂肪組織特異性分泌的激素蛋白，參與能量代謝、維持血糖、血脂平衡。它具有胰島素超敏化作用，能改善胰島素抵抗［1］;參與炎癥反應(yīng)具有抗動脈粥樣硬化作用。在急性腦梗死發(fā)生后的全部病程中ADIPOQ均具有腦保護作用:超早期可抑制ROS產(chǎn)生減少應(yīng)激損傷［2］;發(fā)病早期可抑制炎癥因子 TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1和黏附分子VCAM-1/ICAM-1的生成減輕缺血后炎癥反應(yīng)［3，4］;修復(fù)期可保護血管內(nèi)皮功能，促進缺血組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達以刺激血管新生［5］，同時可誘導(dǎo)缺血組織血管內(nèi)皮eNOS磷酸化，增加血管中NO含量，能擴張血管、增加腦血流量、促進缺血腦組織功能恢復(fù)。動物實驗及臨床研究均證實血漿ADIPOQ水平與腦梗死相關(guān)［3，6］。

腦梗死是遺傳和環(huán)境因素共同作用的多基因疾病，實現(xiàn)在人類全基因組范圍內(nèi)進行關(guān)聯(lián)分析從而確定腦梗死的主要致病基因，現(xiàn)階段仍需繼續(xù)探求與腦梗死關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)數(shù)目。研究提示ADIPOQ基因也是腦梗死易感性的候選基因之一［7］，ADIPOQ基因變異與ADIPOQ水平相關(guān)［8］。但是此基因與腦梗死相關(guān)性的研究較少而且研究結(jié)果不一致，目前尚無關(guān)于ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死易感性的Meta分析。我們在中國北方青島地區(qū)漢族人群中進行ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病病因的相關(guān)性研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 (1)腦梗死組:均為2011年3月～2013年1月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的腦梗死患者，共372例，其中男性182例，女性190例。入組標(biāo)準(zhǔn):診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華神經(jīng)科學(xué)會第四屆全國腦血管病會議修訂的“各類腦血管疾病診斷要點(1995)”。入選病例均經(jīng)頭部CT和(或)MRI證實，并且行經(jīng)顱多普勒、顱腦血管超聲、頭部MRA、心臟超聲檢查，部分患者進一步行CTA、DSA等檢查明確腦血管和心臟病變情況。排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重心、肝、腎功能不全;②心源性栓塞、其他病因或不明原因型腦梗死;③繼發(fā)性腦梗死，如嚴(yán)重感染、腦血管畸形/動脈瘤、血栓性疾病、腫瘤、血液病、自身免疫性疾病等。(2)對照組:為同期查體中心的查體者416例，其中男性216例，女性200例，其性別與年齡與腦梗死組相匹配。入組標(biāo)準(zhǔn):既往無腦梗死病史，頭部CT或MRI證實無腦梗死灶。排除標(biāo)準(zhǔn):同病例組。

1.2 臨床數(shù)據(jù)采集 所有入組者均填寫調(diào)查問卷，內(nèi)容包括研究對象的一般情況(如:姓名、性別、年齡等)、家族史、既往史、吸煙及飲酒史。該研究符合我院所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有入組者均簽署知情同意書。測量血壓、身高、體重、抽取晨起空腹血檢測生化指標(biāo)

1.3 SNPs的選擇 從NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中選取ADIPOQ基因多態(tài)性位點，要求所選位點異型性已知，且其相對少見的等位基因頻率在亞洲人群中＞0.05，最終選擇 3個代表性的 SNPs即rs266729、rs822396及rs2241766進行檢測。

1.4 基因多態(tài)性檢測 所有受試者均于清晨空腹抽取前臂靜脈血5 ml，EDTA抗凝，常溫下2700 rpm/min離心10 min，收集細(xì)胞層，凍存于-80℃冰箱待用。應(yīng)用血液基因組快速抽提試劑盒(上海生工SK8224)提取DNA。rs266729和rs2241766采用PCR-RFLP鑒定基因多態(tài)性(PCR擴增引物和限制性內(nèi)切酶見表1)，分別鑒定出rs266729的3種基因型CC、CG、GG和rs2241766的3種基因型 TT、TG、GG。PCR總反應(yīng)體系10μl:DNA模板100 ng，5 U/μl Taq DNA 擴增酶(上海生工 SK2492)0.1 μl，10×PCR Buffer 1 μl，2 mmol/L dNTP Mix 0.8 μl，25 mmol/L MgCl21μl，上、下游引物各1 μl(2 μmol/μl，上海生工合成)，加雙蒸水至10μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3μl PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，剩余7μl PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶HhaI酶(Thermo scientific ER1851)和 SmaI酶(Thermo scientific ER0661)過夜消化，電泳觀察(150 V 20 min)。隨機抽取部分標(biāo)本經(jīng)測序(上海生工完成)鑒定rs266729和rs2241766的基因型，測序結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果完全相符。rs822396位點因未找到天然內(nèi)切酶，采用直接測序法分析(上海生工完成)，鑒定出AA、AG及GG 3種基因型。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，兩組計量資料比較采用以t檢驗;計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;多因素logistic回歸分析進行ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。SESsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)進行基因分析，基因型和等位基因風(fēng)險率采用相對危險度(odds ratio，OR)表示;用Hardy-Weinberg平衡檢驗確定樣本是否具有群體代表性。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死組和對照組一般臨床資料比較腦梗死組和對照組比較，年齡、性別、飲酒史、總膽固醇、低密度脂蛋白水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);BMI(≥24 kg/m2)、吸煙史、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表 2)。

2.2 等位基因頻率及基因型分布的比較 3個SNP的基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。rs266729的基因型分布在腦梗死組和對照組中有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);rs822396、rs2241766的基因型分布在腦梗死組和對照組中無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.0 5);上述3個SNP的基因頻率在腦梗死組和對照組中無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(見表3)。

2.3 rs266729與腦梗死的相關(guān)性 進一步在顯性、隱性、累加這3種模式下分析rs266729與腦梗死的相關(guān)性。在3種模式下，rs266729的基因型分布在腦梗死組和對照組中有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);rs266729 G等位基因變異能增加腦梗死的易感性(3種模式下 OR 值分別為:1.35、2.15、2.33)(見表4)。

2.4 多因素logistic回歸分析 調(diào)整腦梗死危險因素BMI(≥24 kg/m2)、吸煙史、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平后，多因素logistic回歸分析結(jié)果示顯性模式下rs266729的基因型分布在腦梗死組和對照組中仍有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，GG+GC基因型可增加腦梗死的易感性(OR值=1.44)，G等位基因變異仍是腦梗死的易感危險因素(見表5)。

2.5 單倍型分析 3個SNP位點采用SESsis在線軟件(http://analysisbio-x.cn/myAnalysis.php)進行連鎖不平衡分析，未發(fā)現(xiàn)存在連鎖不平衡。單倍型頻率均＜0.03。

表1 鑒定rs266729和rs2241766位點的PCR引物及限制性內(nèi)切酶

表2 研究對象一般臨床資料分析

表3 ADIPOQ基因3個SNP的基因頻率及基因型分布

表4 rs266729與腦梗死的相關(guān)性

表5 rs266729與腦梗死相關(guān)性的多因素Logistic回歸分析

3 討論

ADIPOQ基因位于染色體3q27上，全長約17 kb，含3個外顯子和2個內(nèi)含子［9］。大量研究發(fā)現(xiàn)染色體3q27區(qū)域能增加2型糖尿病、代謝綜合征及心血管病變的遺傳易感性［10～12］，但是關(guān)于此區(qū)域與腦梗死發(fā)病易感性關(guān)系的研究較少。因此，我們進一步研究位于此區(qū)域的ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)rs266729在顯性、隱性、累加模式下均與腦梗死有相關(guān)性;在調(diào)整腦梗死的危險因素BMI(≥24 kg/m2)、吸煙史、收縮壓、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平后，多因素logistic回歸分析仍表明在顯性模式下rs266729與腦梗死具有相關(guān)性;GG+GC基因型可增加腦梗死的易感性;等位基因G變異是腦梗死易感的危險因素。劉芳等［13］認(rèn)為rs266729 GG基因型和G等位基因可增加中國北方漢族人群腦梗死的風(fēng)險性;陳小良等［14］發(fā)現(xiàn)雖然rs266729與北方漢族總體人群腦梗死易感性無關(guān)，但在女性中GG純合變異增加了腦梗死的易感性。同樣，Yamada等［15］發(fā)現(xiàn)rs266729 GG基因型能增加日本人群中代謝綜合征患者動脈粥樣硬化性腦梗死的風(fēng)險。

上述針對亞洲人群的研究與本研究結(jié)果一致;但是針對美國人群的研究結(jié)果卻相反，Hegener HH［7］等發(fā)現(xiàn)rs266729能降低腦梗死的危險性，這提示rs266729微小等位基因G變異可能具有種族差異性。

rs266729位于ADIPOQ基因啟動子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)其等位基因G與低血漿ADIPOQ水平相關(guān)［16］。在3T3-L1大鼠脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，等位基因G能改變DNA結(jié)合活性從而降低ADIPOQ基因啟動子的活性［17］;同時研究發(fā)現(xiàn)G基因也能降低轉(zhuǎn)錄因子sp1和啟動子結(jié)合位點的親和性［18］。上述因素可引起ADIPOQ基因表達減少，從而導(dǎo)致血漿ADIPOQ水平減少。低血漿ADIPOQ水平與腦梗死相關(guān)［6］，因此rs266729等位基因G變異能增加腦梗死的易感性。

rs822396位于第2個內(nèi)含子區(qū)域，Pischon等［19］發(fā)現(xiàn)rs822396 G基因與美國女性非致命性心肌梗死或致命性冠脈血管病變相關(guān)。My-Young Cheong等［20］研究表明在韓國人群中此位點與腦梗死相關(guān)，而且包含 rs822396在內(nèi)的由 6個 SNP(rs822396、rs822391、rs182052、rs16861205、rs12495941、rs3776241)組成的單倍型(AGGCGG and AAGTAG)與腦卒中相關(guān)。Hegener HH等［7］針對美國人群研究發(fā)現(xiàn)由rs266729/rs182052/rs822396組成的單倍型(GAG)與降低缺血性卒中相關(guān)。國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)rs822396與腦梗死相關(guān)性的研究報告，本研究首次發(fā)現(xiàn)rs822396在顯性、隱性、累加模式下均與腦梗死無相關(guān)性。

rs2241766位于第二個外顯子區(qū)域，等位基因G/T變異為同義變異(GGT-GGG，Gly-Gly)。目前有關(guān)于此位點的研究較多，但結(jié)果差別較明顯。陳小良等［14］研究認(rèn)為rs2241766基因多態(tài)性與中國北方漢族總體人群腦梗死的易感性相關(guān);但劉芳等［13］針對中國北方人群及Hegener HH等［7］針對美國人群的研究結(jié)果卻顯示rs2241766與腦梗死不相關(guān)，這與本研究的結(jié)果一致。同樣，不同學(xué)者關(guān)于rs2241766與冠脈血管病變、糖尿病及高血壓病的易感性的研究結(jié)果也不一致［21］。

同連鎖分析相比，關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果會受到研究人群的遺傳背景、實驗設(shè)計、樣本大小、研究對象的入選標(biāo)準(zhǔn)等多因素影響，因此有必要針對不同種族、不同區(qū)域的人群進行關(guān)聯(lián)性研究。

目前我們僅在美國［7］、亞洲［13～15，21］人群中發(fā)現(xiàn)的這幾項關(guān)于ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死易感性的研究，結(jié)果也不一致。雖然尚不清楚ADIPOQ基因確切的遺傳模式，但本研究確實發(fā)現(xiàn)rs266729 G等位基因變異與增加腦梗死發(fā)病易感性相關(guān)。我們下一步希望重點選取位于連鎖不平衡區(qū)域內(nèi)的SNP位點及擴大樣本進行研究，同時繼續(xù)深入探討ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病易感性相關(guān)的機制。

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