天麻素對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用研究

李文君，徐振田，索大琴，謝安智

(廈門大學醫(yī)學院 基礎醫(yī)學部，福建 廈門 361000)

免疫性炎癥反應參與了缺血性中風后的腦損傷。腦缺血后數小時，受損腦區(qū)域的炎癥反應開始啟動，持續(xù)數天后，使腦缺血所致的遲發(fā)性腦損傷加重。腦缺血后釋放大量自由基、炎癥因子和前炎癥物質，損害中樞神經系統(tǒng)，促使神經細胞死亡，加重缺血性中風的損傷，因此腦缺血損傷中的炎癥反應越來越受到關注［1-3］。天麻(Gastrodia rhizome)為蘭科植物的干燥塊莖，其有效成分天麻素(Gastrodine)對中樞神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有較廣泛的藥理活性，能擴張腦血管、增加腦血流量、提高腦細胞抗缺氧能力［4-5］。天麻素是否影響腦缺血再灌注損傷血腦屏障的通透性，是否影響到缺血半暗帶的炎癥反應，目前尚未見報道。

本研究在大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷模型基礎上，通過測定天麻素對梗死半暗帶皮層組織內TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響，旨在深入研究天麻素對腦缺血過程中炎癥反應的作用，為臨床治療腦缺血提供理論依據和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 天麻素(Gas)，上海永葉生物科技有限公司;兔抗鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6抗體，Abcam 公司，兔抗鼠β-actin單克隆抗體，Santa Cruz公司;ECL發(fā)光系統(tǒng)，聯(lián)科生物公司;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)，美國 Amresco公司;其它均為市售分析純產品。

顯微手術器械，上海醫(yī)療器械有限公司;多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司;Western blot裝置，美國BioRad公司;Kodak IS4000R全自動圖像工作站，美國Kodak公司。

1.2 實驗動物 清潔級SD大鼠120只，雄性，體質量250～300 g，由廈門大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號:SYXK(閩)2013－0003。術前12 h禁食，自由飲水。

1.3 方法

1.3.1 大鼠大腦中脈栓塞腦缺血模型的制備:線拴法制備大鼠右側大腦中動脈栓塞模型(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)［6］。大鼠稱重、麻醉;分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈;用動脈夾夾閉頸總動脈，在頸總動脈和頸內動脈分叉處剪一小口，將線栓經切口處插入大腦中動脈始端，栓塞大腦中動脈，造成局灶性腦缺血，缺血2 h后拔出線栓，即形成再灌注，動物蘇醒后出現對側肢體運動障礙即為模型制備成功。

1.3.2 分組及給藥:為評價Gas對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響，50只SD大鼠隨機分為5組:①假手術組(Sham組):僅手術暴露右側頸總動脈及頸內動脈，不做缺血處理;②溶媒組(Model組):造模后缺血2 h后再灌注;③～⑤Gas給藥組(5、10、20mg/kg組):腦缺血再灌注同時分別給予Gas 5、10、20mg/kg腹腔注射。

1.3.3 免疫印跡:為檢測Gas對大鼠腦缺血后梗死半暗帶炎癥因子的作用，在腦缺血后24 h處死大鼠，取梗死半暗帶皮層組織，加入裂解液冰上裂解30 min后，14 000 r/min離心10 min，上清即為總組織蛋白溶解成分。SDS-PAGE每孔上樣量為50 ug，蛋白經電泳分離后，將膠上蛋白轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，然后分別加入1∶1000稀釋的兔抗大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6多克隆抗體，4℃孵育過夜，再加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，用化學熒光試劑檢測，使用Kodak IS4000R系統(tǒng)檢測成像分析。實驗以β-actin為內參蛋白。

1.3.4 腦損傷的評價

①神經功能缺失評分:大鼠腦缺血后再灌注24 h參照Longer 5分法［7］進行神經功能學評分。

②腦梗死灶體積及腦水腫的測定:大鼠腦缺血后再灌注2 h，斷頭取腦，于－20℃中冷凍30 min，切成2.0 mm厚的冠狀切片，放于1%TTC溶液中，避光37℃恒溫孵育20 min，4%多聚甲醛溶液中避光固定24 h后，運用圖像分析處理軟件計算腦梗死體積。

③血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞程度的觀察和測定:大鼠腦缺血后再灌注6 h，尾靜脈注射質量濃度為5%的伊文思藍(evansblue，EB)，劑量 10mL/kg，18 h 后，給予水合氯醛麻醉后打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向主動脈內緩慢注入生理鹽水，直到右心房流出液體變清亮，斷頭取腦，整腦拍照后，于－20℃中冷凍15 min，切成2.0 mm厚的冠狀切片。未受損的正常腦組織無EB滲透呈白色;梗死側腦組織有大量EB滲透呈藍色，說明血腦屏障受損。用相機按順序拍攝染色后的腦片，用圖像分析與處理軟件計算每個腦片EB滲透面積，EB滲透體積為:面積求和后乘以切片厚度(2 mm)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，正態(tài)計量數據用“±s”表示，組間比較做單因素方差分析，兩兩比較選用LSD-t法分析。

2 結果

2.1 Gas對大鼠腦缺血損傷的保護作用 大鼠腦缺血再灌注后24 h，損傷側腦組織出現明顯的蒼白梗死灶，Gas 10，20mg/kg再灌注同時給藥可劑量依賴性減小腦梗死體積，Gas 5mg/kg無效(圖1a，1b)。大鼠腦缺血再灌后24 h，出現明顯的神經功能損傷，與Sham組相比，神經功能缺失評分明顯升高;Gas給藥組(10、20mg/kg)可減少神經功能缺失評分，并呈劑量依賴性，Gas 5mg/kg組無影響(見圖1c)。

圖1 Gas對大鼠腦缺血的保護作用##P＜0.01，與Sham 組相比;*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與Model組相比Fig.1 Protection effect of Gas on cerebral ischemia rats##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with Model group

2.2 Gas對大鼠腦缺血后BBB通透性的影響 通過EB滲漏法觀察腦缺血再灌注后大鼠BBB通透性的變化，表明腦缺血再灌注后24 h，腦內 EB滲漏量明顯增大(見圖2a)。Gas(20mg/kg)再灌后給藥后EB的滲漏體積與Model組相比明顯減少(P＜0.05)，表明Gas(20mg/kg)可減少EB在腦內的滲漏，減輕腦缺血再灌注后BBB的破壞程度(見圖2b)。

圖2 Gas對大鼠腦缺血后BBB通透性的影響##P＜0.01，與Sham組相比;*P＜0.05，與Model組相比Fig.2 Effect of Gas on BBB disruption in brain ischemia rats##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.3 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶TNF-α蛋白表達的影響 大鼠腦缺血再灌注24 h，皮層梗死半暗帶TNF-α蛋白表達明顯增加，Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時給藥可降低梗死半暗帶TNF-α蛋白表達，抑制率為24%(見圖3)。

圖3 Gas對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織TNF-α蛋白表達的影響##P＜0.01，與Sham組相比;*P＜0.05，與Model組相比Fig.3 Effect of Gas(20mg/kg)on TNF-αexpression in penumbra of cortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.4 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶IL-1β蛋白表達的影響 大鼠腦缺血再灌注后24 h，皮層梗死半暗帶IL-1β蛋白表達明顯增加，Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時給藥可降低梗死半暗帶IL-1β蛋白表達，抑制率為34%(見圖4)。

圖4 Gas(20mg/kg)對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織IL-1β的表達的影響##P＜0.01，與Sham組相比;*P＜0.05，與Model組相比Fig.4 Effect of Gas(20mg/kg)on IL-1βexpression in penumbra ofcortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.5 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶IL-6蛋白表達的影響 大鼠腦缺血再灌注后24 h，皮層梗死半暗帶IL-6蛋白表達明顯增加，Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時給藥可降低梗死半暗帶IL-6蛋白表達，抑制率為38%(見圖5)。

圖5 Gas(20mg/kg)對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織IL-6的表達的影響##P＜0.01，與Sham組相比;*P＜0.05，與Model組相比Fig.5 Effect of Gas(20mg/kg)on IL-6 expression in penumbra of cortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

3 討論

腦血管疾病是繼惡性腫瘤和心血管疾病之后，威脅人類生存與健康的第三大疾病，因具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點，給社會家庭帶來嚴重的經濟和精神負擔，其中缺血性腦血管病占全部腦血管病的80%［7］。隨著我國老齡化趨勢增強，缺血性腦血管疾病患者人數急劇上升。因此，尋找腦缺血保護作用的藥物意義重大。

天麻素是天麻的有效成分。以往研究表明天麻素可不同程度地增加腦血流量，降低血管阻力，抑制神經細胞凋亡［8-9］，改善老齡大鼠的學習記憶等功能［10］。BBB是存在于血液和腦組織之間的一道屏障，對維持中樞神經系統(tǒng)內環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。本實驗采用EB為示蹤劑，觀察腦缺血再灌注后腦內BBB通透性的變化，選取EB在腦內滲漏最明顯的時間即再灌注6 h作為觀察藥物作用的時間點［11］。腦缺血再灌注會破壞BBB完整性，導致血液中的成分滲入腦組織，形成血管源性腦水腫，進一步加重腦損傷。本實驗結果表明:腦缺血再灌注同時給藥Gas(20mg/kg，i.p)可明顯減少EB在腦內的滲漏，說明Gas對腦缺血/再灌注后的BBB具有保護作用，其通過保護BBB的完整性減輕腦缺血再灌注損傷。此外，本研究還表明Gas在改善BBB的同時可減少腦梗死體積及改善神經功能缺失。

炎癥反應是造成腦卒中后繼發(fā)性損傷的主要因素之一［12-13］，腦缺血后再灌注損傷可激活大量炎癥細胞釋放炎癥介質，加重局部腦組織損傷。如何抑制炎性因子釋放，是減輕缺血性腦損傷中一個非常重要的環(huán)節(jié)。TNF-α是一種在誘導炎癥反應中很重要的細胞因子，其在腦缺血早期生成的增加是腦梗塞形成的主要原因［14］。IL-6對于多種細胞的生長、分化與調控都有影響，其過度表達與缺血性腦損傷密切相關。缺血再灌注大鼠與臨床卒中患者的中樞神經系統(tǒng)均會產生IL-6，其表達水平的高低是評價缺血再灌注損傷程度的一個重要指標［15］。本研究通過建立大鼠腦缺血/再灌注模型，證實了Gas可減輕腦缺血神經功能損傷和降低腦梗死體積，且具有劑量依賴性，Gas 20mg/kg的保護作用更為明顯。為了進一步研究Gas腦保護的作用機制，檢測了TNFα、IL-1β和IL-6在梗死半暗帶皮層組織中的表達，結果顯示腦缺血后半暗帶TNFα、IL-1β和IL-6蛋白表達明顯升高，而Gas 20mg/kg可抑制TNFα、IL-1β和IL-6的表達。說明Gas也可通過減輕腦缺血后的炎癥反應，進一步減輕缺血性腦損傷。

本研究結果表明Gas對大鼠腦缺血/再灌注損傷具有保護作用。通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，改善血腦屏障的完整性可能是Gas保護缺血性腦損傷的機制。

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