李文君,徐振田,索大琴,謝安智
(廈門大學醫(yī)學院 基礎醫(yī)學部,福建 廈門 361000)
免疫性炎癥反應參與了缺血性中風后的腦損傷。腦缺血后數小時,受損腦區(qū)域的炎癥反應開始啟動,持續(xù)數天后,使腦缺血所致的遲發(fā)性腦損傷加重。腦缺血后釋放大量自由基、炎癥因子和前炎癥物質,損害中樞神經系統(tǒng),促使神經細胞死亡,加重缺血性中風的損傷,因此腦缺血損傷中的炎癥反應越來越受到關注[1-3]。天麻(Gastrodia rhizome)為蘭科植物的干燥塊莖,其有效成分天麻素(Gastrodine)對中樞神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有較廣泛的藥理活性,能擴張腦血管、增加腦血流量、提高腦細胞抗缺氧能力[4-5]。天麻素是否影響腦缺血再灌注損傷血腦屏障的通透性,是否影響到缺血半暗帶的炎癥反應,目前尚未見報道。
本研究在大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷模型基礎上,通過測定天麻素對梗死半暗帶皮層組織內TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響,旨在深入研究天麻素對腦缺血過程中炎癥反應的作用,為臨床治療腦缺血提供理論依據和實驗支持。
1.1 主要實驗試劑與儀器 天麻素(Gas),上海永葉生物科技有限公司;兔抗鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6抗體,Abcam 公司,兔抗鼠β-actin單克隆抗體,Santa Cruz公司;ECL發(fā)光系統(tǒng),聯(lián)科生物公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC),美國 Amresco公司;其它均為市售分析純產品。
顯微手術器械,上海醫(yī)療器械有限公司;多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司;Western blot裝置,美國BioRad公司;Kodak IS4000R全自動圖像工作站,美國Kodak公司。
1.2 實驗動物 清潔級SD大鼠120只,雄性,體質量250~300 g,由廈門大學醫(yī)學院實驗動物中心提供,合格證號:SYXK(閩)2013-0003。術前12 h禁食,自由飲水。
1.3 方法
1.3.1 大鼠大腦中脈栓塞腦缺血模型的制備:線拴法制備大鼠右側大腦中動脈栓塞模型(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)[6]。大鼠稱重、麻醉;分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈;用動脈夾夾閉頸總動脈,在頸總動脈和頸內動脈分叉處剪一小口,將線栓經切口處插入大腦中動脈始端,栓塞大腦中動脈,造成局灶性腦缺血,缺血2 h后拔出線栓,即形成再灌注,動物蘇醒后出現對側肢體運動障礙即為模型制備成功。
1.3.2 分組及給藥:為評價Gas對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響,50只SD大鼠隨機分為5組:①假手術組(Sham組):僅手術暴露右側頸總動脈及頸內動脈,不做缺血處理;②溶媒組(Model組):造模后缺血2 h后再灌注;③~⑤Gas給藥組(5、10、20mg/kg組):腦缺血再灌注同時分別給予Gas 5、10、20mg/kg腹腔注射。
1.3.3 免疫印跡:為檢測Gas對大鼠腦缺血后梗死半暗帶炎癥因子的作用,在腦缺血后24 h處死大鼠,取梗死半暗帶皮層組織,加入裂解液冰上裂解30 min后,14 000 r/min離心10 min,上清即為總組織蛋白溶解成分。SDS-PAGE每孔上樣量為50 ug,蛋白經電泳分離后,將膠上蛋白轉印到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,然后分別加入1∶1000稀釋的兔抗大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6多克隆抗體,4℃孵育過夜,再加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗,37℃孵育1 h,用化學熒光試劑檢測,使用Kodak IS4000R系統(tǒng)檢測成像分析。實驗以β-actin為內參蛋白。
1.3.4 腦損傷的評價
①神經功能缺失評分:大鼠腦缺血后再灌注24 h參照Longer 5分法[7]進行神經功能學評分。
②腦梗死灶體積及腦水腫的測定:大鼠腦缺血后再灌注2 h,斷頭取腦,于-20℃中冷凍30 min,切成2.0 mm厚的冠狀切片,放于1%TTC溶液中,避光37℃恒溫孵育20 min,4%多聚甲醛溶液中避光固定24 h后,運用圖像分析處理軟件計算腦梗死體積。
③血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)破壞程度的觀察和測定:大鼠腦缺血后再灌注6 h,尾靜脈注射質量濃度為5%的伊文思藍(evansblue,EB),劑量 10mL/kg,18 h 后,給予水合氯醛麻醉后打開胸腔,于右心耳部剪一小口,從左心室插入導管至主動脈,向主動脈內緩慢注入生理鹽水,直到右心房流出液體變清亮,斷頭取腦,整腦拍照后,于-20℃中冷凍15 min,切成2.0 mm厚的冠狀切片。未受損的正常腦組織無EB滲透呈白色;梗死側腦組織有大量EB滲透呈藍色,說明血腦屏障受損。用相機按順序拍攝染色后的腦片,用圖像分析與處理軟件計算每個腦片EB滲透面積,EB滲透體積為:面積求和后乘以切片厚度(2 mm)。
1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析,正態(tài)計量數據用“±s”表示,組間比較做單因素方差分析,兩兩比較選用LSD-t法分析。
2.1 Gas對大鼠腦缺血損傷的保護作用 大鼠腦缺血再灌注后24 h,損傷側腦組織出現明顯的蒼白梗死灶,Gas 10,20mg/kg再灌注同時給藥可劑量依賴性減小腦梗死體積,Gas 5mg/kg無效(圖1a,1b)。大鼠腦缺血再灌后24 h,出現明顯的神經功能損傷,與Sham組相比,神經功能缺失評分明顯升高;Gas給藥組(10、20mg/kg)可減少神經功能缺失評分,并呈劑量依賴性,Gas 5mg/kg組無影響(見圖1c)。
圖1 Gas對大鼠腦缺血的保護作用##P<0.01,與Sham 組相比;*P<0.05,**P<0.01,與Model組相比Fig.1 Protection effect of Gas on cerebral ischemia rats##P<0.01,compared with Sham group;*P<0.05,**P<0.01,compared with Model group
2.2 Gas對大鼠腦缺血后BBB通透性的影響 通過EB滲漏法觀察腦缺血再灌注后大鼠BBB通透性的變化,表明腦缺血再灌注后24 h,腦內 EB滲漏量明顯增大(見圖2a)。Gas(20mg/kg)再灌后給藥后EB的滲漏體積與Model組相比明顯減少(P<0.05),表明Gas(20mg/kg)可減少EB在腦內的滲漏,減輕腦缺血再灌注后BBB的破壞程度(見圖2b)。
圖2 Gas對大鼠腦缺血后BBB通透性的影響##P<0.01,與Sham組相比;*P<0.05,與Model組相比Fig.2 Effect of Gas on BBB disruption in brain ischemia rats##P<0.01,compared with Sham group;*P<0.05,compared with Model group
2.3 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶TNF-α蛋白表達的影響 大鼠腦缺血再灌注24 h,皮層梗死半暗帶TNF-α蛋白表達明顯增加,Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時給藥可降低梗死半暗帶TNF-α蛋白表達,抑制率為24%(見圖3)。
圖3 Gas對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織TNF-α蛋白表達的影響##P<0.01,與Sham組相比;*P<0.05,與Model組相比Fig.3 Effect of Gas(20mg/kg)on TNF-αexpression in penumbra of cortex tissue after cerebral ischemia##P<0.01,compared with Sham group;*P<0.05,compared with Model group
2.4 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶IL-1β蛋白表達的影響 大鼠腦缺血再灌注后24 h,皮層梗死半暗帶IL-1β蛋白表達明顯增加,Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時給藥可降低梗死半暗帶IL-1β蛋白表達,抑制率為34%(見圖4)。
圖4 Gas(20mg/kg)對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織IL-1β的表達的影響##P<0.01,與Sham組相比;*P<0.05,與Model組相比Fig.4 Effect of Gas(20mg/kg)on IL-1βexpression in penumbra ofcortex tissue after cerebral ischemia##P<0.01,compared with Sham group;*P<0.05,compared with Model group
2.5 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶IL-6蛋白表達的影響 大鼠腦缺血再灌注后24 h,皮層梗死半暗帶IL-6蛋白表達明顯增加,Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時給藥可降低梗死半暗帶IL-6蛋白表達,抑制率為38%(見圖5)。
圖5 Gas(20mg/kg)對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織IL-6的表達的影響##P<0.01,與Sham組相比;*P<0.05,與Model組相比Fig.5 Effect of Gas(20mg/kg)on IL-6 expression in penumbra of cortex tissue after cerebral ischemia##P<0.01,compared with Sham group;*P<0.05,compared with Model group
腦血管疾病是繼惡性腫瘤和心血管疾病之后,威脅人類生存與健康的第三大疾病,因具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點,給社會家庭帶來嚴重的經濟和精神負擔,其中缺血性腦血管病占全部腦血管病的80%[7]。隨著我國老齡化趨勢增強,缺血性腦血管疾病患者人數急劇上升。因此,尋找腦缺血保護作用的藥物意義重大。
天麻素是天麻的有效成分。以往研究表明天麻素可不同程度地增加腦血流量,降低血管阻力,抑制神經細胞凋亡[8-9],改善老齡大鼠的學習記憶等功能[10]。BBB是存在于血液和腦組織之間的一道屏障,對維持中樞神經系統(tǒng)內環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。本實驗采用EB為示蹤劑,觀察腦缺血再灌注后腦內BBB通透性的變化,選取EB在腦內滲漏最明顯的時間即再灌注6 h作為觀察藥物作用的時間點[11]。腦缺血再灌注會破壞BBB完整性,導致血液中的成分滲入腦組織,形成血管源性腦水腫,進一步加重腦損傷。本實驗結果表明:腦缺血再灌注同時給藥Gas(20mg/kg,i.p)可明顯減少EB在腦內的滲漏,說明Gas對腦缺血/再灌注后的BBB具有保護作用,其通過保護BBB的完整性減輕腦缺血再灌注損傷。此外,本研究還表明Gas在改善BBB的同時可減少腦梗死體積及改善神經功能缺失。
炎癥反應是造成腦卒中后繼發(fā)性損傷的主要因素之一[12-13],腦缺血后再灌注損傷可激活大量炎癥細胞釋放炎癥介質,加重局部腦組織損傷。如何抑制炎性因子釋放,是減輕缺血性腦損傷中一個非常重要的環(huán)節(jié)。TNF-α是一種在誘導炎癥反應中很重要的細胞因子,其在腦缺血早期生成的增加是腦梗塞形成的主要原因[14]。IL-6對于多種細胞的生長、分化與調控都有影響,其過度表達與缺血性腦損傷密切相關。缺血再灌注大鼠與臨床卒中患者的中樞神經系統(tǒng)均會產生IL-6,其表達水平的高低是評價缺血再灌注損傷程度的一個重要指標[15]。本研究通過建立大鼠腦缺血/再灌注模型,證實了Gas可減輕腦缺血神經功能損傷和降低腦梗死體積,且具有劑量依賴性,Gas 20mg/kg的保護作用更為明顯。為了進一步研究Gas腦保護的作用機制,檢測了TNFα、IL-1β和IL-6在梗死半暗帶皮層組織中的表達,結果顯示腦缺血后半暗帶TNFα、IL-1β和IL-6蛋白表達明顯升高,而Gas 20mg/kg可抑制TNFα、IL-1β和IL-6的表達。說明Gas也可通過減輕腦缺血后的炎癥反應,進一步減輕缺血性腦損傷。
本研究結果表明Gas對大鼠腦缺血/再灌注損傷具有保護作用。通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放,改善血腦屏障的完整性可能是Gas保護缺血性腦損傷的機制。
[1]Chrissobolis S,Millera A,Drummond GR,etal.Oxidative stress and endothelial dysfunction in cerebrovascular disease[J].Front Biosci,2011,(16):1733-1745.
[2]Zhang YY,Liu Y,Fu ST,etal.Cerebral ischemic damage and inflammatory reaction[J].Chin Pharmacol Bull,2006,22(1):5-9.
[3]劉金鳳,周宇,楊武雙,等.油酰乙醇胺在小鼠急性局灶性腦缺血再灌注中的作用及機制[J].中國生化藥物雜志,2012,33(6):758-761.
[4]鄧華.天麻素注射液治療慢性腦供血不足的療效觀察[J].生物醫(yī)學工程,2011,19(11):70-71.
[5]聶晶,杜亮,陸遠富,等.天麻素對腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞凋亡的抑制作用[J].重慶醫(yī)學,2012,41(18):1841-1842.
[6]Mao Y,Yang GY,Zhou LF,etal.Focal cerebral ischemia in the mouse:description of a model and effects of permanent and temporary occlusion[J].Brain Res Mol Brain Res,1999,63(2):366-370.
[7]Liu PK,Grossman RG,Hsu CY,etal.Ischemic injury and faulty gene transcripts in the brain [J].Trends in neurosciences,2001,24(10):581-588.
[8]陶陶,徐堅,董佑忠,等.天麻超微粉與普通粉對大鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞凋亡的研究[J].中國醫(yī)藥學報,2004,19(7):409-411.
[9]Wang Y,Wu Z,Liu X,etal.Gastrodin ameliorates Parkinson's disease by downregulating connexin 43[J].Molecular Medicine Reports,2013,8(2):585-590.
[10]高南南,于澎仁,徐錦堂.天麻對老齡大鼠學習記憶的改善作用[J].中國中藥雜志,1995,20(9):562-568.
[11]Strbiand,Durukana,Pitkonenm,etal.The blood brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia[J].Neuroscience,2008,153(1):175-181.
[12]Chen B,Liao WQ,Xu N,etal.Adiponectin protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through anti-inflammatory action[J].Brain Res,2009,1273(4):129-137.
[13]丁麗君,董志,樂樂樂,等.西維來司鈉對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用及機制[J].中國藥理學通報,2011,27(1):54-58.
[14]Clark IA,Alleva LM,Vissel B,etal.The roles of TNF in brain dysfunction and disease[J].Pharmacol Ther,2010,128(3):519-548.
[15]Suzuki S,Tanaka K,Nagata E,etal.Cerebral neurons express in terleukin-6 after transient forebrain ischemia in gerbils[J].Neurosci Lett,1999,262(2):117-120.