UPLC法測(cè)定乳制品中的納他霉素

（國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)中心（新疆），新疆烏魯木齊 830011）

納他霉素又稱(chēng)游鏈霉素，是一種重要的多烯類(lèi)大環(huán)內(nèi)酯抗菌素。納他霉素在大多數(shù)食品的pH范圍內(nèi)非常穩(wěn)定，是一種天然、廣譜、高效安全的酵母菌及霉菌等絲狀真菌抑制劑，它不僅能夠抑制真菌，還能防止絲狀真菌中黃曲霉毒素的產(chǎn)生[1-3]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.5 mg/kg～10 mg/kg的納他霉素含量即可抑制絕大多數(shù)霉菌，其對(duì)霉菌的抑菌能力是普通化學(xué)防腐劑的30倍～50倍[4]。由于納他霉素具有無(wú)致突變、致癌、致畸和致敏作用，不誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，目前該產(chǎn)品已經(jīng)在50多個(gè)國(guó)家得到廣泛使用[5]。1997年我國(guó)衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)納他霉素作為食品防腐劑，但是在乳粉、酸奶、純牛奶等乳制品中不允許使用[6]。但經(jīng)過(guò)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一些乳制品企業(yè)仍在其生產(chǎn)中使用納他霉素。

目前文獻(xiàn)報(bào)道中，納他霉素的分析方法主要有高效液相色譜法[7-11]、薄層層析法[12]、紫外風(fēng)光光度法[13-15]、微生物法[16]等，高效液相色譜法已經(jīng)列入國(guó)標(biāo)方法[17]。但由于液相分析中基質(zhì)干擾嚴(yán)重，產(chǎn)品中的納他霉素“假陽(yáng)性”驗(yàn)證工作也非常重要。本試驗(yàn)在現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上建立了乳制品中納他霉素殘留量的檢測(cè)方法，該方法前處理簡(jiǎn)單，回收率及靈敏度高，準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性好，適用于監(jiān)控乳制品廠家納他霉素的添加殘留量，從而保障食品安全；并在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探討了幾種“假陽(yáng)性”驗(yàn)證方法，對(duì)檢測(cè)工作的準(zhǔn)確性和質(zhì)檢部門(mén)的權(quán)威性有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（HPLC級(jí)）：美國(guó)Fisher公司；冰乙酸（優(yōu)級(jí)純）：中國(guó)上海國(guó)藥公司；納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters ACQULITY UPLC H-class高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器、高速冷凍離心機(jī)）：德國(guó)SIGMA公司；超純水儀：開(kāi)普勒公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；TSQ access Quantum高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀：Thermo Fisher Scientific公司；電子分析天平：梅特勒托利多公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、線性范圍及最低檢出限、回收率

精確稱(chēng)取10 mg納他霉素，轉(zhuǎn)移到10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容到刻度，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，避光，放入-20℃冰箱中備用。準(zhǔn)確量取儲(chǔ)備液，用高純水稀釋定容，配制納他霉素的濃度梯度為 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 并測(cè)定出最低檢出限。選用在空白樣品中添加納他霉素，測(cè)定乳制品中的回收率。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY BEH C18，流動(dòng)相：水∶甲醇=55 ∶45，流速：200 μL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣體積：1 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：303 nm。

1.5 前處理方法

稱(chēng)取樣品5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入15 mL甲醇，超聲提取30 min，加水定容至25 mL，搖勻，冰箱冷凍1 h。取樣液過(guò)孔徑0.22 μm濾膜，進(jìn)行液相色譜分析。

1.6 測(cè)定及定性定量方法

在本文選定的色譜條件下，分別吸取1 μL樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)分析。根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽(yáng)性樣品色譜圖如圖1所示。

圖1 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽(yáng)性樣品色譜圖Fig.1 Spectra of natamycin standard solution and positive sample

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190 nm～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，最大吸收波長(zhǎng)在303 nm處（如圖2所示），因此選擇303 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的確定

本實(shí)驗(yàn)考察了反相色譜常用的流動(dòng)相：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.01%甲酸水。結(jié)果表明流動(dòng)相中是否加酸對(duì)靈敏度及保留能力影響不大，同時(shí)由于乙腈毒性較大且價(jià)格昂貴，最終選擇了甲醇-水為流動(dòng)相。對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)水∶甲醇=55∶45時(shí)，納他霉素基本可以和基質(zhì)完全分離，且靈敏度較高。

圖2 納他霉素200-400nm UV光譜圖Fig.2 200-400 nm UV spectra of natamycin

2.3 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

將納他霉素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.2，0.8，2.0，4.0，8.0μg/mL）按照1.4節(jié)中的條件進(jìn)樣分析。以納他霉素的質(zhì)量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，得線性方程為Y=2.48×107X+3.31×103，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。以3倍噪聲值與最小濃度的色譜峰峰高比較，計(jì)算出檢出限為0.02μg/mL，根據(jù)前處理方法計(jì)算，該方法的最低檢出限為0.1mg/kg，表明乳制品中納他霉素含量在0.1 mg/kg～40 mg/kg時(shí)具有良好的線性關(guān)系。

2.4 回收率的測(cè)定

在酸奶、奶酪空白樣品中添加3個(gè)濃度水平的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，做回收率試驗(yàn)，結(jié)果列于表1。

表1 納他霉素在乳制品中的回收率Table 1 Recovries of natamycin in dairy

在納他霉素濃度的3個(gè)水平上，回收率在92.5%～98.1%（n=6）之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）0.92%～2.13%。因此，該方法準(zhǔn)確度、重復(fù)性良好。

2.5 “假陽(yáng)性”樣品的驗(yàn)證方法

由于基質(zhì)的復(fù)雜性，本方法的前處理方法難以消除部分基質(zhì)干擾，在定性方面有一定的弊端，容易引起假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可以通過(guò)以下方法進(jìn)行“假陽(yáng)性”驗(yàn)證。

2.5.1 加標(biāo)法

對(duì)疑似陽(yáng)性的樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，若加標(biāo)樣品流出的色譜峰并未出現(xiàn)新的組分或肩峰，呈現(xiàn)出完好的對(duì)稱(chēng)性，且保留時(shí)間基本不變，則初步判斷為陽(yáng)性（如圖3所示），但仍有分離效果差導(dǎo)致兩者不能分離的可能。

圖3 樣品與加標(biāo)后樣品納他霉素的色譜圖Fig.3 Natamycin chromatogram of sample and addingstandarded sample

2.5.2 雙柱法

雙柱法是常用的假陽(yáng)性驗(yàn)證方法之一。通過(guò)改變色譜柱，即改變納他霉素的保留性，可改變納他霉素的保留時(shí)間，再將樣品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照，即可確定是否存在“假陽(yáng)性”。如圖4所示。

圖4 不同色譜柱的納他霉素色譜圖Fig.4 Natamycin chromatogram on different columns

更換后的色譜柱保留較強(qiáng)，納他霉素延后出峰，若兩種色譜柱上樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰均一致，則可判斷為陽(yáng)性樣品。

2.5.3 改變流動(dòng)相極性法

圖5 不同流動(dòng)相比例下納他霉素的色譜圖Fig.5 Natamycin chromatogram at different ratio of mobile phase

改變流動(dòng)相組成或者配比，即可改變流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，同樣也可以改變納他霉素的保留時(shí)間，確定樣品是陰性樣品還是陽(yáng)性樣品。如圖5所示，將pH=3.0乙酸水溶液與甲醇比例由55∶45改變?yōu)?0∶40，流動(dòng)相洗脫能力減弱，納他霉素出峰時(shí)間延后，若在不同的流動(dòng)相比例下樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間均能保持一致，則判斷為陽(yáng)性樣品。

2.5.4 分光光度法

當(dāng)納他霉素殘留量較高時(shí)，分光光度法也可進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)4 μg/mL和樣品進(jìn)行測(cè)試，光譜圖如圖6所示，吸收波長(zhǎng)303 nm和320 nm光區(qū)干擾較少，基本可以判定樣品是否含有納他霉素。

圖6 標(biāo)液和陽(yáng)性樣品的光譜圖比較Fig.6 Comparison of spectra of standard solution and sample

2.5.5 二極管陣列檢測(cè)器法

對(duì)于聯(lián)有二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器可以對(duì)分離后的色譜圖進(jìn)行光譜分析，驗(yàn)證色譜峰的光譜圖及其純度，可以進(jìn)行陽(yáng)性驗(yàn)證。若光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰型差別很大，則判為“假陽(yáng)性”；若光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰型基本類(lèi)似，則有可能混有其它物質(zhì)，需要進(jìn)一步分離后才能定性定量；若光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰型基本一致，只有吸光度大小的差異，則判為陽(yáng)性樣品。

2.5.6 高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[18]

樣品經(jīng)過(guò)液相色譜分離后，進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器。質(zhì)譜法采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Selective Reaction Monitoring，SRM）掃描模式，子離子風(fēng)度比進(jìn)行定性，消除了基質(zhì)干擾，是目前最準(zhǔn)確的定性方式。陽(yáng)性樣品不但總離子流圖與標(biāo)準(zhǔn)溶液基本一致（如圖7a和7c所示），子離子及選定的子離子風(fēng)度比均與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一致（如圖7b和7d所示）。而“假陽(yáng)性”樣品在離子流圖上或者不出峰，或者離子風(fēng)度比與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)差別不在允許誤差范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本文建立了納他霉素的常規(guī)液相色譜檢測(cè)方法，該方法前處理簡(jiǎn)單，回收率及靈敏度高，準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性好，適用于日常的食品監(jiān)督工作。同時(shí)，也討論了常用的“假陽(yáng)性”驗(yàn)證方法，對(duì)消除“假陽(yáng)性”、維護(hù)質(zhì)檢部門(mén)的權(quán)威性有著一定的的現(xiàn)實(shí)意義。

圖7a 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig.7a Total ion current of natamycin

圖7b 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液定性離子與定量離子Fig.7b Qualitative ion and quantitative ion of natamycin standard

圖7c 陽(yáng)性樣品總離子流圖Fig.7c Total ion current of positive sample

圖7d 陽(yáng)性樣品定性離子與定量離子Fig.7d Qualitative and quantitative ion of negative sample