金黃色葡萄球菌三種定量檢驗(yàn)方法的比較

劉海卿，佘之蘊(yùn)，陳丹玲，李姣，蘇妙儀，張施敬，王力清

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東順德528300）

金黃色葡萄球菌（StaphyLoccocus aureus）是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一，據(jù)美國(guó)CDC報(bào)告，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希氏菌，居第2位，占細(xì)菌性食物中毒的33%[1]。國(guó)際上一般認(rèn)為金黃色葡萄球菌≥105CFU/g就會(huì)產(chǎn)生腸毒素，發(fā)生金黃色葡萄球菌腸毒素中毒，會(huì)出現(xiàn)惡心、劇烈反復(fù)嘔吐癥狀，并伴有上腹痛及腹瀉，體溫一般不高，1 d～2 d可恢復(fù)[2]。國(guó)際食品微生物規(guī)格委員會(huì)（ICMSF）已對(duì)金黃色葡萄球菌的危害度進(jìn)行評(píng)估，將其列為中度直接局部傳播性病原菌。目前，世界各國(guó)都把金黃色葡萄球菌檢測(cè)列為食品衛(wèi)生的法定檢測(cè)項(xiàng)目[3]。

常用金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)方法有三種：GB 4789.10-2010、SN/T 1895-2007 和 Baird-Parker瓊脂+RPF（兔血漿）快速培養(yǎng)法，這些方法各有利弊。GB 4789.10-2010實(shí)驗(yàn)步驟分四步，時(shí)間上約需78 h，SN/T 1895-2007和快速培養(yǎng)法只需一步，24 h可獲得檢測(cè)結(jié)果。本文將這3種方法對(duì)不同濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液進(jìn)行定量檢測(cè)，進(jìn)而比較總結(jié)，在不同食品污染程度時(shí)，適當(dāng)選擇，對(duì)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出金葡菌含量有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和菌懸液的制備

金黃色葡萄球菌[ATCC 6538]。

取-70℃條件下保存于含15%無菌丙三醇的金黃色葡萄球菌，轉(zhuǎn)種至第二代營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，用0.85%生理鹽水稀釋，制備1.0麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?，再?.85%生理鹽水梯度稀釋。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

7.5%氯化鈉肉湯；Baird-Parker平板：廣州環(huán)凱技術(shù)生物有限公司。兔血漿：青島海博生物技術(shù)有限公司。3MPerifilmTM金黃色葡萄球菌測(cè)試片：美國(guó)3M公司。Baird-Parker瓊脂+RPF（兔血漿）：生物梅里埃公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

高壓滅菌鍋：日本ALP。隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法

GB 4789.10-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》第二法[4]。

1.2.2 金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法

SN/T 1895-2007《食品中金黃色葡萄球菌的快速計(jì)數(shù)法PetrifilmTM測(cè)試片法》[5]。

1.2.3 Baird-Parker瓊脂+RPF（兔血漿）快速培養(yǎng)法

培養(yǎng)基配制：先將R1（Brird-Parker瓊脂）瓶中的瓊脂在100℃的水浴中約45 min溶解，將R1室溫放置至少15 s，而后將其放入45℃的水浴設(shè)備保溫，另外加10 mL室溫?zé)o菌水至R2試劑（RPF兔血漿）中，將其溶解后加入已降溫至45℃的R1，立即旋轉(zhuǎn)混勻。

接種培養(yǎng)：取每個(gè)稀釋度的菌液1 mL于無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿，及時(shí)將20 mL混勻后的培養(yǎng)基傾入平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置于培養(yǎng)箱，（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，結(jié)果以CFU/mL表示。

1.2.4 三種方法比較

三種方法檢驗(yàn)流程及典型菌落形態(tài)確認(rèn)見表1。

表1 三種方法比較Table 1 Comparison of three kinds of test process

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

選用三個(gè)稀釋度的菌懸液，100CFU/mL～103CFU/mL濃度檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 三種方法檢測(cè)100CFU/mL～103CFU/mL濃度金黃色葡萄球菌懸液的結(jié)果Table 2 Results of the three methods in determining the concentrationofS.aureusintheconcentrationof100CFU/mL-103CFU/mL

在103CFU/mL濃度時(shí)三種方法的平均值相差較大，因此增加此梯度的平行試驗(yàn)，三種方法檢測(cè)103CFU/mL濃度金黃色葡萄菌懸液的10個(gè)平行結(jié)果見表3。

表3 三種方法檢測(cè)103CFU/mL濃度金黃色葡萄球菌懸液的結(jié)果Table 3 ResuLts of the three methods in determining the concentration of S.aureus in the concentration of 103CFU/mL

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在103CFU/mL菌懸液濃度范圍時(shí)，SN/T 1895-2007與Baird-Parker瓊脂+RPF（兔血漿）快速培養(yǎng)法結(jié)果接近（P=0.712＞0.05），GB 4789.10-2010與另外兩種方法結(jié)果有顯著差異（P=0.000＜0.05），另外GB 4789.10-2010的計(jì)數(shù)結(jié)果值較高。

3 討論

1）在低于103CFU/mL濃度時(shí)3種方法結(jié)果無明顯差異，對(duì)非仲裁檢驗(yàn)單位有十分重要的實(shí)際意義，SN/T 1895-2007方法和Baird-Parker瓊脂+RPF（兔血漿）快速培養(yǎng)法方便易行，避免了GB 4789.10-2010方法多個(gè)步驟的繁瑣環(huán)節(jié)，操作簡(jiǎn)便，且檢測(cè)時(shí)間較短，便于加工企業(yè)每批樣品抽檢。但相比于GB 4789.10-2010，這兩個(gè)方法的耗材較貴，檢驗(yàn)成本較高。

2）金黃色葡萄球菌在Baird-Parker瓊脂+RPF（兔血漿）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，陽性菌呈黑灰色，周圍沉淀環(huán)明顯，此結(jié)果易與其他形態(tài)菌落區(qū)分，結(jié)果易判讀便于計(jì)數(shù)。

3）在實(shí)際的檢測(cè)工作中，對(duì)不同樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)注意根據(jù)實(shí)際金黃色葡萄球菌污染程度選擇合適的方法，這樣既可提高檢測(cè)速度，又可確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。