富硒食用菌硒蛋白清除氧自由基作用研究

楊奇，郭陽，徐銳，谷學(xué)軍，張瑩，鐵梅，*

（1.遼寧大學(xué)化學(xué)院，遼寧沈陽110036；2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110036；3.遼寧大學(xué)稀散元素研究所，遼寧沈陽110036）

人體內(nèi)的自由基被認為會引起生物細胞氧化性損傷，進而引起癌癥、衰老、心血管疾病等慢性病[1-4]。與人關(guān)系最密切的自由基有、·OH和ROO·。的毒性是機體發(fā)生氧中毒的主要原因，表現(xiàn)在使核酸鏈斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化作用，進而造成遺傳突變、膜損傷、酶系失靈等一系列變化[5]。在體內(nèi)形成最早，通過岐化反應(yīng)或Fenton反應(yīng)可生成·OH。·OH對細胞的破壞作用最強，同時也是脂質(zhì)過氧化的引發(fā)劑[6]。因此對自由基清除能力的研究，對相關(guān)疾病的防治有著重要的意義。

食用菌不僅味道鮮美，營養(yǎng)豐富，而且含有一些對人體非常有益的活性物質(zhì)，被人體吸收后可產(chǎn)生多種生理功能，例如抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和降血脂等[7]。硒是人體必需的微量元素，其生理功能主要表現(xiàn)為硒蛋白和硒酶的抗氧化作用[8]，使生物體內(nèi)的過氧化物還原成無毒的水或醇，從而達到清除活性氧自由基的目的[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)靈芝中硒蛋白具有清除羥自由基和超氧陰離子的作用[11]，但對富硒金針菇和富硒蟲草中硒蛋白的抗氧化性的研究較少。本研究利用甲基紫-Fe2+-H2O2體系[12]和鄰苯三酚自氧化體系[13]分別研究了富硒食用菌中硒蛋白清除羥自由基和超氧陰離子的活性，為富硒食用菌的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HZQ-Q全溫震蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；冷凍離心機：美國科峻電器公司；PHSJ-4A型酸度計：上海雷磁儀器廠；7500c型ICP-MS：美國Agilent公司；Cary 50紫外-可見分光光度計：美國VARIAN公司。濃鹽酸（優(yōu)級純）：北京化工廠；考馬斯亮藍G250（分析純）、鄰苯三酚（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨（分析純）、30%過氧化氫（分析純）：沈陽力誠試劑廠；甲基紫（分析純）：沈陽市試劑三廠；硫酸亞鐵（分析純）：沈陽新興試劑廠；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 硒蛋白的制備

稱取富硒食用菌干樣1.0 g，加20 mL，pH為3.5的Tris-HCl溶液，在全溫振蕩器攪拌提取2.0 h，抽濾至干，濾液保留，收集殘渣，重復(fù)操作1次，合并濾液。根據(jù)溶液體積準(zhǔn)確稱量一定量的硫酸銨，邊攪拌邊向燒杯中緩慢加入硫酸銨至其飽和度為95%，透析后，分別以考馬斯亮藍染色法[14]和ICP-MS法[15]測蛋白濃度C蛋白和硒含量C硒，其余放在-20℃下儲藏備用。

1.2.2 硒蛋白對羥自由基的清除作用

H2O2和Fe2+發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH。·OH容易進功高電子云密度點，會與甲基紫中具有高電子云密度的-C=C-基團發(fā)生親電加成反應(yīng)，而使甲基紫褪色。通過測定甲基紫吸光度值的變化可間接測定出·OH的生成量。

在10 mL比色管中依次加入1.4 mL 2×10-4mol/L的甲基紫溶液、0.1 mL 0.1 mol/L pH=3.5的Tris-HCl溶液、1.2mL 1×10-3mol/L的Fe2+溶液。另一試管加入上述試劑，再加1 mL 0.12%的H2O2溶液，兩試管均用去離子水補足10.0mL，搖勻，放置30 min后，在波長582 nm處測定吸光度，計算加H2O2與不加H2O2的A582之差△A582。

在上述體系中，加入一定量的硒蛋白提取物，搖勻后再加H2O2，30 min后測定吸光度，則硒蛋白清除率S按以下公式計算：

1.2.3 硒蛋白對超氧陰離子自由基的清除率作用

在試管中按表1加入緩沖溶液和二次蒸餾水，于25℃恒溫20 min后加入25℃預(yù)熱過的鄰苯三酚（對照管用0.01 mol/L鹽酸代替），迅速搖勻，立即傾入光徑1 cm的比色杯中，在波長320 nm處測定反應(yīng)啟動后4.5 min時的吸光度值A(chǔ)空。

表1 鄰苯三酚自養(yǎng)化速率測定加樣表Table 1 Protocol of the pyrogallol autoxidation velocity operation

在上述體系中，加入鄰苯三酚前，先加入一定量的硒蛋白，并減少同體積二次蒸餾水，其它操作均與上述相同，所測吸光度為A樣。則硒蛋白清除率S按以下公式計算

1.2.4 硒蛋白對超氧陰離子自由基生成的抑制率測定

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白及硒含量的確定

ICP-MS法測定硒含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，考馬斯亮藍染色法測定蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the content of the selenium

圖2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of the content of the protein

經(jīng)考馬斯亮藍法和ICP-MS法測定，蟲草硒蛋白C硒為 19.352 3 μg/L，C蛋白為 126.17 mg/L， 金針菇硒蛋白 C硒為 19.574 8 μg/L，C硒為 95.83 mg/L。

2.2 硒蛋白對羥自由基的清除作用

按照產(chǎn)生羥自由基工作原理設(shè)計的反應(yīng)體系，分別加入C蛋白空白蛋白、C硒Se的亞硒酸鈉溶液、硒含量C硒的富硒食用菌硒蛋白，使得蛋白質(zhì)的濃度或硒的濃度在同一水平，加入量1、3、5 mL，從而分為由低到高三種不同的濃度組，在波長582 nm處測定吸光度。根據(jù)公式（1）得到清除率如下。

從圖中可以看出不同濃度的亞硒酸鈉、普通食用菌蛋白和硒蛋白對羥自由基均有清除作用，并且隨著濃度的增大，清除率隨之增加，但較緩慢。硒蛋白對羥自由基的清除效果要明顯好于與之濃度相同的亞硒酸鈉和普通食用菌蛋白的效果。無論是低濃度，還是高濃度，空白蛋白和亞硒酸鈉對·OH的清除率之和小于富硒食用菌蛋白對·OH的清除率，且存在極顯著差異，說明硒與食用菌蛋白之間在清除自由基方面存在協(xié)同作用。

圖3 富硒蟲草硒蛋白對羥自由基的清除率Fig.3 The scavenging effects of selenoprotein of Se-enriched Cordyceps militaris on hydroxyl radical

圖4 富硒金針菇硒蛋白對羥自由基的清除率Fig.4 The scavenging effects of selenoprotein of Se-enriched Flammulina velutipes on hydroxly radical

2.3 對超氧陰離子自由基的清除作用

按照產(chǎn)生超氧陰離子工作原理設(shè)計的反應(yīng)體系，分別加入不同量的C蛋白空白蛋白、C硒Se的亞硒酸鈉溶液、硒含量C硒的富硒食用菌硒蛋白，使得蛋白質(zhì)的濃度或硒的濃度在同一水平，在波長320 nm處測定吸光度。根據(jù)公式（2）得到清除率如下。

圖5 富硒蟲草硒蛋白對的清除率Fig.5 The scavenging effects of selenoprotein of Se-enriched Cordyceps militaris on superoxide anion

圖6 富硒金針菇硒蛋白對的清除率Fig.6 The scavenging effects of selenoprotein of Se-enriched Flammulina velutipes on superoxide anion

從圖中可以看出不同體積的亞硒酸鈉、普通食用菌蛋白和硒蛋白對超氧陰離子均有清除作用，隨著體積的增加，三者對的清除率呈上升趨勢，但幅度不大。在用量為3 mL時，趨于平緩。在不同濃度下，富硒食用菌蛋白對的清除率均高于普通食用菌蛋白以及亞硒酸鈉，說明硒增強了食用菌蛋白消除的活性。富硒食用菌蛋白對的清除率小于空白蛋白和亞硒酸鈉對的清除率之和，說明硒與食用菌蛋白之間在清除方面不存在協(xié)同作用。

2.4 對超氧陰離子自由基的抑制作用

根據(jù)公式（3）得到抑制率如圖7和圖8。

圖7 富硒蟲草硒蛋白對生成的抑制率Fig.7 The inhibitting effects of selenoprotein of Seenriched Cordyceps militaris to superoxide anion free radical

圖8 富硒金針菇硒蛋白對生成的抑制率Fig.8 The inhibitting effects of selenoprotein of Se-enriched Flammulina velutipes to superoxide anion free radical

從圖中可以看出不同用量的亞硒酸鈉、普通食用菌蛋白和硒蛋白對超氧陰離子的生成均有抑制作用，且抑制率隨著三者的用量增大而增大。富硒食用菌蛋白對生成的抑制作用均顯著高于普通食用菌蛋白以及亞硒酸鈉。

2.5 硒蛋白對·OH和的清除能力比較

當(dāng)富硒食用菌硒蛋白的用量相同時，考察其對羥自由基和超氧陰離子的清除作用。

圖9 硒蛋白對兩種自由基的清除作用比較Fig.9 Comparision of selenoprotein scvenging capacity between·OH and

從圖9中可以看到不論是蟲草硒蛋白，還是金針菇硒蛋白，對羥自由基的清除作用顯著地強于超氧陰離子。

3 結(jié)論

通過研究得到以下結(jié)論：（1）富硒食用菌硒蛋白對羥自由基和超氧陰離子都有一定的清除作用。在一定范圍內(nèi)硒蛋白濃度越高，其清除率越強。（2）硒蛋白對·OH具有良好的清除作用，且清除效果要比與其相同濃度的無機硒、及蛋白都要明顯，硒與食用菌蛋白之間存在協(xié)同作用。（3）硒蛋白在清除超氧陰離子時，富硒食用菌蛋白對的清除率均高于普通食用菌蛋白以及亞硒酸鈉，說明硒增強了食用菌蛋白消除的活性，但硒與食用菌蛋白之間不存在協(xié)同作用。（4）硒蛋白濃度相同條件下，對羥自由基的清除作用強于對超氧陰離子。