偏頭痛相關(guān)酶和KEGG通路分析

黃 瑞，鄭 珩

(中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京210009)

偏頭痛(migraine，MIM 157300)是一種普遍的原發(fā)性頭痛，主要表現(xiàn)為中重度、搏動(dòng)樣發(fā)作性頭痛，多為偏側(cè)，一般持續(xù)4～72小時(shí)，可伴惡心、嘔吐、畏光、畏聲及典型的眼前閃光和視野缺損等非頭痛癥狀，是神經(jīng)內(nèi)科最常見(jiàn)的慢性神經(jīng)血管疾病。偏頭痛的發(fā)病率高，健康壽命損失年YLD2000(Years Lived with Disability)數(shù)據(jù)顯示偏頭痛在人類致殘疾病中排名19，全球疾病負(fù)擔(dān)GBD2010(Global Burden of Disease)顯示偏頭痛在所有致死致殘疾病中排名30［1］，年患病率男性為 0.7% ～16.1%，女性為 3.3%～32.6%［2］，男女患病率比約為 1∶3，研究表明偏頭痛的性別偏好跟遺傳因素和雌激素等有關(guān)。偏頭痛有很多亞型，1988年國(guó)際頭痛協(xié)會(huì)(IHS)第一次公布偏頭痛的分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)，后于2004年修訂后將偏頭痛分為6大類和17小類［3-4］，為了研究方便，特別是針對(duì)偏頭痛的遺傳學(xué)研究，通常將偏頭痛分為三大類:無(wú)先兆性偏頭痛(migraine without aura，MO)，先兆性偏頭痛(migraine with aura，MA)，家族偏癱型偏頭痛(Familial hemiplegic migraine，F(xiàn)HM)。

偏頭痛的病因復(fù)雜多樣，并受種族、年齡、性別影響，主要包括環(huán)境因素、遺傳因素和心理因素，其中先兆性偏頭痛通常由遺傳因素決定。常見(jiàn)的環(huán)境因素包括精神因素(如緊張、抑郁)、身體因素(如疲勞、睡眠不足、年齡)、飲食不規(guī)律(如過(guò)飽、饑餓)、生活習(xí)慣(如吸煙、酗酒)、藥物(如避孕藥)、食物(如干酪、味精、巧克力)等，因此偏頭痛患者應(yīng)避免自身誘發(fā)因素。偏頭痛基因研究是近年來(lái)偏頭痛研究的重點(diǎn)，截止2013年，以(gene OR polymorphism OR mutation OR variat*)AND(migraine)為檢索式，搜索SCI數(shù)據(jù)庫(kù)得到2 409條記錄，其中2000～2013年的年平均發(fā)表量為138，這些研究結(jié)合臨床病例報(bào)告，探討偏頭痛的發(fā)病機(jī)制，也為新藥研究提供更多有效的靶點(diǎn)。

1 偏頭痛相關(guān)編碼酶基因

通過(guò)文獻(xiàn)查閱得到偏頭痛遺傳相關(guān)酶基因31個(gè)(見(jiàn)表1)。根據(jù)每個(gè)基因的Pubmed文獻(xiàn)記錄，將31個(gè)偏頭痛候選基因分為三大類:①基因多態(tài)性研究表明與偏頭痛病癥相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因，包括14個(gè):ACE、ATP1A2、C10orf2、DBH、DDC、F2、INSR、MEP1A、MMP3、NSDHL、TPH1、TPH2、TREX1、TYMS;②缺少多態(tài)性研究，但與治療偏頭痛的藥物代謝有關(guān)的基因，包括 3個(gè):CYP3A4、REN、TH;③既有多態(tài)性研究又參與藥物代謝的基因，包括14個(gè):COMT、CYP1A2、GSTM1、MAOA、MMP2、MMP9、MTHFD1、MTHFR、MTRR、NOS1、NOS2、NOS3、POLG、PTGS2。

表1 偏頭痛遺傳相關(guān)編碼酶基因列舉Table 1 Lists of migraine genes encoding enzymes

續(xù)(表1)

2 KEGG通路分析

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識(shí)庫(kù)，其子數(shù)據(jù)庫(kù)PATHWAY匯集了分子交互作用及其反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)人工通路圖。

2.1 DAVID分析工具

DAVID(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)訪問(wèn)的功能注釋系統(tǒng)，網(wǎng)址為 http://david.abcc.ncifcrf.gov/。利用DAVID工具分析KEGG pathway可以直觀觀測(cè)到基因的富集通路、目標(biāo)基因?qū)?yīng)的蛋白及相互關(guān)系，若分析某一疾病相關(guān)基因 ID，則可根據(jù) PVALUE(P＜0.05)值確定重要的PATHWAY來(lái)進(jìn)行重點(diǎn)分析，有助于了解疾病的分子學(xué)病理，并為新藥的研發(fā)提供有效參考靶點(diǎn)。

2.2 DAVID操作過(guò)程

本文針對(duì)31個(gè)偏頭痛相關(guān)編碼酶基因，進(jìn)行KEGG路徑分析，具體過(guò)程如下:

STEP1:進(jìn) 入 網(wǎng) 址 http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp;

STEP2:Uploade框架中粘貼基因 ID，31個(gè)，1個(gè)/行;

圖1 偏頭痛相關(guān)酶KEGG pathway路徑列表Fig.1 KEGG pathway lists of migraine related enzyme genes

STEP3:在“Select Identifier”下拉框中選擇“ENTREZ_GENE_ID”;

STEP4:在“l(fā)ist type”選項(xiàng)中點(diǎn)擊“Gene List”

STEP5:點(diǎn)擊“submit list”;

STEP6:List框架中“USE”相應(yīng)數(shù)據(jù)集打開(kāi)分析結(jié)果，在“Pathways”下拉框中點(diǎn)擊“KEGG_PATHWAY_Chart”打開(kāi)路徑列表。

3 結(jié)果及分析

利用DAVID在線分析工具對(duì)31個(gè)偏頭痛相關(guān)酶基因的KEGG路徑進(jìn)行分析，13個(gè)基因ID未顯示在通路中，結(jié)果得到18個(gè)酶基因富集在7條路徑上(見(jiàn)圖1):色氨酸代謝通路(Tryptophan metabolism)、酪氨酸代謝通路(Tyrosine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝通路(Arginine and proline metabolism)、葉酸一碳單位循環(huán)代謝通路(One carbon pool by folate)、藥物代謝通路(Drug metabolism)、外源物質(zhì)細(xì)胞色素P450代謝通路(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)、腎素血管緊張素代謝通路(Renin-angiotensin system)。

表2顯示7條通路各自富集的目標(biāo)基因，基因MAOA在四條通路中皆有顯示，根據(jù)在通路中出現(xiàn)的位置可推測(cè)以單胺氧化酶為靶點(diǎn)的藥物可以影響:血清素的生成和消除調(diào)節(jié)、多巴胺的消除以及去甲腎上腺素的生成和代謝、半胱氨酸水平調(diào)節(jié)、影響藥物代謝(citalopram，即西酞普蘭，CAS［59729-33-8］，抗抑郁藥)等多個(gè)方面發(fā)揮藥理作用，提示影響單胺氧化酶活性和分布的藥物可作為研究偏頭痛新藥的靶點(diǎn)，并提示在偏頭痛用藥過(guò)程中，如曲坦類藥物治療急性偏頭痛時(shí)要考慮與單胺氧化酶抑制劑(MOAI)的藥物相互作用，不過(guò)目前有研究表明MAOI對(duì)曲坦類藥物代謝的藥代動(dòng)力學(xué)影響可忽略不計(jì)［36］。從表2中得到CYP450酶分布在3條代謝通路中，主要功能為參與外源性物質(zhì)以及藥物的代謝，如CYP450影響曲坦類藥物的代謝:eletriptan，frovatriptan，naratriptan，zolmitriptan 等［37］。

表2 7條代謝通路及目標(biāo)基因Table 2 List of seven KEGG pathways and relative genes

3.1 色氨酸代謝通路

色氨酸代謝通路富集了5個(gè)目標(biāo)基因，觀察得知其中最重要的路徑為血清素的生成和代謝路徑:tryptophan

色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)是血清素合成的限速酶，包括TPH1和TPH2兩種異構(gòu)體，分別由11號(hào)染色體和12號(hào)染色體編碼，基因序列一致性為71%，TPH1主要表達(dá)在分泌5-羥色胺的組織中，如皮膚、腸道、松果體以及中樞神經(jīng)系統(tǒng);而TPH2則僅在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，且TPH2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)量比TPH1大。雖然TPH在血清素的合成中占有很重要的位置，而且血清素水平異常又是偏頭痛病理的主要特征，但是TPH與偏頭痛的多態(tài)性研究不多，且目前沒(méi)有以TPH為治療靶點(diǎn)的偏頭痛藥物，可能的原因是偏頭痛的血清素水平異常跟5-羥色胺受體的關(guān)聯(lián)比較大，而跟血清素的合成沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。有研究顯示TPH1(rs1800532)多態(tài)性影響西酞普蘭(citalopram)藥效［38］，西酞普蘭是治療重度抑郁癥的藥物，在偏頭痛的治療中有少量應(yīng)用。

多巴脫羧酶(dopa decarboxylase，DDC)催化5-羥色氨酸脫羧生成血清素，同時(shí)在酪氨酸代謝通路中催化左旋多巴生成多巴胺，可是關(guān)于DDC多態(tài)性與偏頭痛關(guān)系的研究欠缺，只有 Corominas R［39］等通過(guò)單倍體分析得到(DDCrs2329340A-rs11974297C-rs2044859T-rs11761683G)與MA有關(guān)聯(lián)。

單胺氧化酶A(monoamine oxidase A，MAOA)參與血清素的降解(5種降解路徑的一條)，即將5-羥色胺降解為5-羥基吲哚乙醛，多態(tài)性研究顯示MAOA-u VNTR與慢性偏頭痛(chronic migraine，CM)以及無(wú)先兆性偏頭痛(migraine without aura，MO)有關(guān)［16］，并且參與曲坦類藥物代謝，包括:sumatriptan、rizatriptan、almotriptan、zolmitriptan 等［37］。

3.2 酪氨酸代謝通路

圖2為酪氨酸代謝通路目標(biāo)基因即星號(hào)集中部分。

圖2 酪氨酸代謝通路部分(星號(hào)集中區(qū)域)Fig.2 Part of Tyrosine metabolism pathway(stars highly concentrated region)

表3為酪氨酸代謝通路中星號(hào)標(biāo)記的酶及對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因，COMT和MAOA出現(xiàn)頻率都高達(dá)6，可見(jiàn)這兩個(gè)酶在多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)的合成的降解中占有重要位置，而偏頭痛患者除了頭痛外常伴有多巴胺能系統(tǒng)癥狀如嘔吐、眩暈等，多巴胺受體激動(dòng)劑和拮抗劑在偏頭痛預(yù)防和急性發(fā)作治療中都有應(yīng)用。

表3 酪氨酸代謝通路目標(biāo)基因和出現(xiàn)頻率Table 3 Target genes and corresponding frequency of Tyrosine metabolism pathway

多巴胺合成路徑也是左旋多巴唯一的降解途徑，起關(guān)鍵作用的酶是DDC，正如在色氨酸通路中提到DDC可以作用于左旋羥基色氨酸生成血清素，以及催化左旋色氨酸生成色胺。DDC由7p12.2基因編碼，目前尚缺乏針對(duì)DDC多態(tài)性和偏頭痛關(guān)系的研究，相應(yīng)的藥物是甲基多巴，一種治療高血壓的藥物，可以用作偏頭痛的預(yù)防。

多巴胺 β羥化酶(dopamine beta-hydroxylase，DBH)由9q34基因編碼，催化多巴胺生成去甲腎上腺素。多態(tài)性研究表明 DBH19bp(-4784～-4803)插入和缺失、-1021C＞T(rs1611115)多態(tài)性和偏頭痛有關(guān)［40］，突變導(dǎo)致DBH水平偏低，造成多巴胺/去甲腎上腺素比例失調(diào)，交感神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，從而引發(fā)偏頭痛。目前針對(duì)多巴胺系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的偏頭痛藥物作用靶點(diǎn)主要是:多巴胺受體(DRD1/2)、腎上腺素受體(β-腎上腺素受體)等，相應(yīng)藥物常見(jiàn)有麥角胺生物堿、奧氮平等，分別用于偏頭痛的預(yù)防和治療，但尚未開(kāi)發(fā)以DBH為靶點(diǎn)的藥物，或者以調(diào)節(jié)多巴胺/腎上腺素比例為藥理的藥物。

3.3 精氨酸脯氨酸代謝通路

該通路富集了3種一氧化氮合酶，神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS，或NOS1)，分布于神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，由12號(hào)染色體編碼，分別是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS，或NOS2)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS，或NOS3)，并分別被12號(hào)、17號(hào)、7號(hào)染色體編碼。如圖3所示，一氧化氮合酶催化左旋精氨酸代謝為NO，NO作為一種特殊的中樞神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)中樞感覺(jué)傳播，同時(shí)有舒張血管的作用，并參與炎癥反應(yīng)。非選擇性NOS抑制劑用于治療急性偏頭痛有舒張血管的副作用，所以開(kāi)發(fā)以nNOS選擇性抑制劑可以治療患有高血壓的偏頭痛患者［41］。

圖3 精氨酸脯氨酸代謝通路(一氧化氮合成和代謝部分通路)Fig.3 Arginine and proline metabolism(part of pathway of NO synthesis and metabolism)

3.4 葉酸一碳單位循環(huán)代謝通路

偏頭痛相關(guān)酶基因KEGG通路分析顯示有三個(gè)目標(biāo)基因富集于葉酸一碳單位循環(huán)通路，目標(biāo)基因和相應(yīng)的酶的位置見(jiàn)圖4。目前研究表明偏頭痛的發(fā)生與患者體內(nèi)半胱氨酸水平明顯升高有關(guān)，而半胱氨酸的代謝與葉酸、B12有關(guān)，同時(shí)研究顯示MTHFR C677T純合子與半胱氨酸高水平有關(guān)。半胱氨酸(HCY)水平升高引發(fā)偏頭痛的病理基礎(chǔ)可能是:高HCY水平影響內(nèi)皮和血管平滑肌功能，導(dǎo)致血管順應(yīng)性下降，從而局部釋放血管活性止痛物質(zhì)，如降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)等，這些物質(zhì)使受累動(dòng)脈更加擴(kuò)張，從而引起頭痛，形成惡性循環(huán)。

MTHFD1基因編碼三種酶:5，10-亞甲基四氫葉酸脫氫酶(EC 1.5.1.5;EC 1.5.1.15);5，10-亞甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶(EC 3.5.4.9);10-甲酰四氫葉酸合成酶(EC 6.3.4.3)。以上3種酶都在葉酸一碳單位循環(huán)代謝通路中發(fā)揮作用，Pubmed關(guān)于MTDFD1多態(tài)性與偏頭痛關(guān)系的研究論文只有一篇，Agustín Oterino等［35］研究結(jié)果表示 MTHFD1 R653Q多態(tài)性影響MTHFR T677的表達(dá)。偏頭痛與葉酸代謝、半胱氨酸代謝有關(guān)，而通路分析又顯示MTHFD1是偏頭痛相關(guān)酶基因中主要影響葉酸代謝的基因，所以有關(guān)于MTHFD1多態(tài)性與偏頭痛的研究有待增加。

圖4 葉酸一碳代謝通路Fig.4 One carbon pool by folate pathway

TYMS 基因編碼胸苷酸合成酶(EC 2.1.1.45)，以5，10-亞甲基四氫葉酸為輔助因子，催化脫氧尿苷酸甲基化，生成脫氧胸苷酸，參與DNA復(fù)制和修復(fù)。胸苷酸合成酶作為癌癥化療藥物靶點(diǎn)之一，是五氟脲嘧啶、5氟2脫氧尿苷以及葉酸類似物的基本作用位點(diǎn)。有關(guān)TYMS多態(tài)性與偏頭痛的研究極少，Agustín Oterino 等［35］研究表示該基因啟動(dòng)子串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性與MTHFR T677協(xié)同作用于提高偏頭痛患發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

3.5 藥物代謝通路

偏頭痛相關(guān)酶KEGG通路分析得到9個(gè)藥物代謝與CYP450、MAOA有關(guān)，藥物信息及相關(guān)應(yīng)用見(jiàn)表4。Citalopram即西酞普蘭，在治療偏頭痛中應(yīng)用不大，但作為高選擇性的SSRIs，其本身及相關(guān)衍生物可以為偏頭痛的新藥研究提供參考。偏頭痛患者基因多態(tài)性不僅影響患病率和發(fā)病程度，還能通過(guò)影響藥物代謝影響偏頭痛的治療效果。在偏頭痛患者個(gè)體化治療中要考慮種族突變和家族突變，并避免藥物相互作用。

表4 藥物代謝通路顯示的藥物信息Table 4 Nine drugs in Drug metabolism pathway

3.6 外源物質(zhì)細(xì)胞色素P450代謝通路

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶1(GSTM1)是人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。Kusumi M［14］多態(tài)性研究表明GSTM1純合子缺失多態(tài)性與MO有關(guān)，但缺乏大樣本和基于人群(population-based)的研究。偏頭痛的發(fā)病機(jī)制與環(huán)境因素有關(guān)，常見(jiàn)有煙、酒、碳酸飲料等，而不同的個(gè)體表現(xiàn)出不同的影響程度，原因可能和代謝外源物質(zhì)的相關(guān)基因的多態(tài)性有關(guān)，可見(jiàn)系統(tǒng)地研究偏頭痛患者解毒系統(tǒng)基因突變有助于偏頭痛的治療和預(yù)防。

3.7 腎素血管緊張素代謝通路

研究表明腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)與偏頭痛病理相關(guān)［51］，該通路包括兩個(gè)目標(biāo)基因:ACE、REN(見(jiàn)圖5)，其中以ACE為靶點(diǎn)的藥物有血管緊張素酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEIs)和血管緊張素 II受體阻滯劑(angiotensin II receptor blockers，ARBs)，普遍用于偏頭痛的預(yù)防治療。腎素是一個(gè)天門冬酰胺蛋白水解酶，催化血管緊張素原降解生成血管緊張素Ⅰ，是RAS系統(tǒng)一級(jí)頻率限速酶。腎素由位于人1號(hào)染色體的REN基因編碼，目前缺乏該基因多態(tài)性與偏頭痛的關(guān)聯(lián)研究。

圖5 腎素血管緊張素代謝通路Fig.5 Renin-angiotensin system pathway

4 結(jié)論

本論文從原始文獻(xiàn)中搜索得到偏頭痛相關(guān)編碼酶基因31個(gè)，并通過(guò)KEGG通路分析鎖定7條目標(biāo)通路，分析得到6個(gè)多態(tài)性研究靶點(diǎn):DDC、DBH、MTHFD1、TYMS、GSTM、REN。以上6個(gè)基因編碼的酶在偏頭痛相關(guān)代謝通路中占有重要的位置，針對(duì)這些基因進(jìn)行大樣本基因多態(tài)性研究將有助于了解偏頭痛的病理基礎(chǔ)，并為偏頭痛患者的治療提供參考。該研究通過(guò)分析偏頭痛相關(guān)酶的分布和基本功能，發(fā)現(xiàn)了若干以酶為靶點(diǎn)的藥物研究范圍，如以西酞普蘭為藥物研究前提，開(kāi)發(fā)更多針對(duì)偏頭痛治療的SSRIs。此外，單胺氧化酶和細(xì)胞色素P450對(duì)偏頭痛藥物和外源性誘發(fā)頭痛因素都有代謝調(diào)節(jié)作用。

31個(gè)目標(biāo)基因中有13個(gè)基因沒(méi)有被富集到通路中，這些基因是:ATP1A2、C10orf2、F2、INSR、MEP1A、MMP3、NSDHL、TREX1、MMP2、MMP9、MTRR、POLG、PTGS2。原因是 DAVID分析工具分析結(jié)果很難涵蓋所有目標(biāo)基因。雖然如此，對(duì)偏頭痛相關(guān)酶基因進(jìn)行通路分析結(jié)果依然有參考價(jià)值，對(duì)其他遺傳疾病也可作類似分析。

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