Helicobacter pylori 26695基因組尺度代謝研究進展

游麗斌，劉冬娟，李 娟 ，方慧生*

(1.中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇南京210009;2.南京市鼓樓醫(yī)院血液科，江蘇南京210008)

近些年，基因組學的迅速發(fā)展為科學家們探究生命規(guī)律提供全新的方法。全基因組測序拓寬了我們對細菌基因組的了解，序列信息為研究細菌的遺傳學改變和適應性突變體的特征帶來新的啟發(fā)。另一方面，利用序列信息可以識別功能基因、重構功能單位網絡甚至整個通路網絡。在基因組測序和海量注釋的基礎上，基因組尺度代謝網絡的重構發(fā)展成熟起來，它通過結合序列和基因功能注釋信息，把基因編碼的蛋白質所催化的生化反應構建成代謝網絡，反映出參與代謝過程的基因-蛋白質-反應之間的相互關系，并有效地轉化為數學模型在計算機上進行模擬、分析［1］?；蚪M尺度代謝網絡模型可應用于:與高通量技術結合并有效地分析、處理高通量數據;指導代謝工程;基于假設指導有目的性的發(fā)現研究;探究物種間關系;分析網絡特性［2］。

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，是從胃黏膜中分離出來的一種彎曲樣桿菌。它是導致慢性胃炎和消化性潰瘍的主要原因，1994年世界衛(wèi)生組織/國際癌癥研究機構(WHO/IARC)將幽門螺桿菌定為Ⅰ類致癌原。1997年，H.pylori 26695菌株的全基因組測序完成，2003 年，Boneca［6］進行了第一次H.pylori 26695基因組注釋工作，該版本注釋包含編碼序列1 590條，其中功能基因1 080個。Schilling和Thiele等先后在2002年和2005年重構了H.pylori 26695的代謝網絡模型，分別是iCS291［4］和 iIT341［5］。iIT341 模型對目的基因預測的準確率不高，模型的質量仍有待進一步提高。2013 年，Resende等［6］對 H.pylori 26695 基因組進行了重新注釋，該版本包含1 573個CDS，功能基因1 212個，與代謝相關基因712個，并找到191個新功能蛋白，該版本注釋可為構建新的高質量代謝網絡模型提供基礎。一般重構過程分為三個步驟:初步構建、驗證完善、數學模擬。第一步一般可編程或用軟件自動完成，最重要的驗證完善步驟貫穿重構始終，數學模擬的目的也包括評估網絡的質量。目前完善一個高質量的代謝網絡仍需要大量人工校對工作，如驗證基因-蛋白質-反應關系需要查閱大量相關文獻。結合更多幽門螺桿菌特異性的研究成果，將基因的預測信息和實驗結果結合有助于指導針對H.pylori的治療。

本文以幾個重要代謝通路為主線，結合近幾年H.pylori 26695與代謝有關的酶與基因組關系的研究成果，闡述H.pylori 26695的主要代謝通路及其特點。除另有說明外，本文討論的 H.pylori即 H.pylori 26695。以“HP”開頭的基因號和以“Hp”開頭的蛋白質名稱表示H.pylori特有的基因編號和蛋白質名稱。

1 H.pylori的營養(yǎng)需要

H.pylori是一種嗜二氧化碳并且微量需氧的微生物，在大氣中需提供5% ～10%CO2，它即可適應微氧條件(＜5%O2)，也可適應有氧條件(一般為21%O2)。H.pylori某些特性會隨著培養(yǎng)環(huán)境中氧含量而變化，包括溶血素的產生、甲硝噠唑耐藥性、鐵氧還蛋白氧化還原酶活性、誘導上皮細胞的改變的能力［7］。目前認為H.pylori生長必需氨基酸包括:精氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、頡氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸。Testerman等［8］進一步研究發(fā)現，在以上氨基酸為基礎的化學限定培養(yǎng)基上同時加入非必需的色氨酸和異亮氨酸有助于細菌生長，而單獨加入時沒有效果，而且在有色氨酸和異亮氨酸的培養(yǎng)基上再加入谷氨酸或谷氨酰胺都能大大加速細菌生長。離子濃度是影響細菌生長的限制性因素，而氨基酸濃度對細菌生長沒有影響。該研究證明H.pylori生長還需要鈉、氯化鉀、硫胺素、鐵、鋅、鎂、次黃嘌呤和丙酮酸，而銅不是其生長所需。

關于H.pylori生長必需氨基酸，基因組分析從另一個角度為以上結果做出佐證。比如，重構H.pylori甲硫氨酸的從頭合成途徑時發(fā)現，在H.pylori基因組中只找到一個編碼硫醚γ-合成酶的基因——HP0106，而缺少編碼從頭合成過程其他酶的基因。另一方面，雖然甲硫氨酸補充途徑普遍存在于所有類型生物體中，但在H.pylori基因組中除了HP0089，還未發(fā)現其他編碼甲硫氨酸補充途徑所需酶的基因，故認為H.pylori無法合成甲硫氨酸。再如，蘇氨酸脫氨和乙酰醇酸合成是亮氨酸合成的前提，但H.pylori基因組中缺少編碼以上兩種酶的基因，所以亮氨酸是維持菌株生長所必需。H.pylori無法從分支酸合成苯丙氨酸，也是因為缺少編碼磷酸甘油酸脫水酶的基因。H.pylori基因組缺少合成硫胺素前體的幾個關鍵酶的基因，但是 Barison等［9］發(fā)現HP1287所編碼的4-氨基-2-甲基-5-(氨甲基)嘧啶氨基水解酶可能參與了合成硫胺素前體的補充途徑，他們克隆純化了該蛋白，其晶體結構顯示酶活性位點改變，而且酶活力實驗顯示該酶對4-氨基-2-甲基-5-(氨甲基)嘧啶底物的親和力不強，這些變化所具有的重要意義需要進一步證實。

2 H.pylori重要代謝通路

2.1 中心代謝

2.1.1 糖代謝

H.pylori所屬的彎曲桿菌屬的其他細菌大都無法分解代謝碳水化合物，但H.pylori可以通過氧化和發(fā)酵方式代謝D-葡萄糖或D-半乳糖。HP1174編碼一種鈉離子依賴性轉運蛋白，H.pylori利用該轉運蛋白將D-葡萄糖或D-半乳糖主動轉運至細胞內進而參與代謝［10］?；蚍治鼋Y果也表明H.pylori糖代謝途徑與大腸桿菌相同，包括糖酵解/糖異生途徑、磷酸戊糖途徑、杜德洛夫途徑(Entner-Doudoroff pathway)。參與上述途徑的相應基因在H.pylori基因組中幾乎都能找到，除了糖酵解途徑中編碼磷酸果糖激酶的基因(pfk)和編碼丙酮酸激酶的基因(pyk)，還有糖異生途徑中編碼葡萄糖-6-磷酸酶的基因(g6p)和磷酸戊糖途徑中編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因(gnd)［11］。丙酮酸是糖酵解和杜德洛夫途徑的共同產物，它可能代謝為乳酸、乙酸進而與三羧酸循環(huán)、呼吸鏈聯系起來。

2.1.2 三羧酸循環(huán)

三羧酸循環(huán)在細胞代謝過程中主要有兩種作用:為其他合成代謝提供小分子前體，如α-酮戊二酸、乙酰乙酰輔酶A、草酰乙酸;氧化乙酰單位產生CO2，通過生成還原型核苷酸，將能量存于ATP中。因為H.pylori缺少編碼α-酮戊二酸脫氫酶復合物的基因，但存在編碼鐵氧還蛋白氧化還原酶的相似基因HP0588-HP0591，所以 H.pylori三羧酸循環(huán)與標準型的三羧酸循環(huán)有所不同，H.pylori三羧酸循環(huán)如圖1所示。H.pylori三羧酸循環(huán)中富馬酸酶將富馬酸轉為蘋果酸，實驗表明，富馬酸酶可與鉍離子結合，而鉍治療是現今治療胃炎的一種方法，該結果提示三羧酸循環(huán)通路可成為H.pylori鉍治療的靶標［12］。Kather等提出，蘋果酸生成草酰乙酸的反應由HP0086編碼的醌氧化還原酶介導，該酶不同于蘋果酸脫氫酶以NAD+為電子受體而以醌為電子受體［13］。由于幽門螺桿菌臨床分離株具有多樣性和變異性，臨床上還沒有診斷和疫苗的“金標準”抗原，以NAD(P)為輔因子的異檸檬酸脫氫酶被認為是潛在的血清學診斷監(jiān)測的分子靶標。Huang等利用克隆、表達、重組等技術研究H.pylori SS1菌株異檸檬酸脫氫酶的生化特性，為臨床上診斷、監(jiān)測H.pylori感染情況提供了有用信息［14］。

圖1 H.pylori三羧酸循環(huán)概略圖Fig.1 Krebs cycle of H.pylori

2.2 氨基酸代謝

氨基酸代謝是H.pylori代謝的重要環(huán)節(jié)，因為它是碳、氮、能量的主要來源。H.pylori的大部分氨基酸代謝過程遵循與大腸桿菌一樣的過程，體現一定的物種間保守性，但更重要的是有一部分基因體現出H.pylori的物種特異性，利用物種特異性可以發(fā)現分子靶標，開發(fā)抗菌藥物。比如，HP0290編碼合成賴氨酸所需的二氨基庚酸脫羧酶，它被認為是抗菌藥物的靶點，分析晶體結構發(fā)現酶的誘導契合機理——下游活性位點loop區(qū)環(huán)住催化中間體進而釋放產物，該結構分析有助于找到酶的特異性抑制劑［15］。

Shibayama等發(fā)現，H.pylori無法吸收胞外的天冬酰胺，而是通過HP0723編碼的天冬酰胺酶把胞外的天冬酰胺水解為天冬氨酸而運至細胞內［16］。與天冬酰胺的情況類似，H.pylori也無法吸收谷氨酰胺和谷胱甘肽，而是將其在胞外水解為谷氨酸，水解谷氨酰胺的酶是γ-谷氨酰轉移酶，它由兩個亞基組成，源于一個HP1118編碼的前體蛋白［17］。胞外水解產物谷氨酸由HP1506編碼的鈉離子依賴性谷氨酸轉運蛋白轉運至細胞內［18］。以上兩種水解酶與幽門螺桿菌感染的致病機制密切相關，天冬酰胺酶抑制T細胞增殖［16］，γ -谷氨酰轉移酶誘發(fā)細胞凋亡、抑制胃細胞和T細胞的增殖［19］。Rimbara等研究臨床上幽門螺桿菌感染引起的胃癌、胃潰瘍病人的分離株，并分析天冬酰胺酶與γ-谷氨酰轉移酶活性［20］。他們提出，γ-谷氨酰轉移酶的高活性而引起谷氨酰胺的消耗是導致強烈炎癥反應的原因，并非谷胱甘肽和天冬酰胺的消耗。并且，在動物模型中添加額外的谷氨酰胺顯示出積極效果［21］，但額外的谷氨酰胺是否能降低幽門螺桿菌感染后胃癌發(fā)生風險有待進一步分析。

HP0549編碼谷氨酸鹽消旋酶，該酶介導D-型和L-型谷氨酸鹽的可逆轉換，它是細胞壁合成的必需酶。Mixcoha等用分子動力學模擬揭示谷氨酸鹽消旋酶的催化機理，催化反應用三至四步完成四次連續(xù)的質子轉移［22］。吡唑并嘧啶二酮類化合物是谷氨酸鹽消旋酶的選擇性抑制劑［23］，在化合物中心支架加上咪唑環(huán)能夠增加藥物口服生物利用度［24］。

分支酸是合成芳香族氨基酸的前體，分支酸合成途徑又叫做“莽草酸途徑”——以磷酸烯醇丙酮酸和磷酸赤蘚糖為起點，經過7種酶的介導合成分支酸(見圖2)。莽草酸途徑是所有微生物和植物的基本代謝功能，而動物體內不存在，所以該通路的所有酶成為抗菌藥物設計的靶標。例如，第二步與第四步酶分別對NAD+和NADP+具有依賴性，可通過找到抑制物阻礙酶與NAD+、NADP+結合從而阻斷莽草酸途徑。Liu等［25］測定H.pylori脫氫奎尼酸合成酶-NAD+復合物晶體結構，找到了抑制物結合口袋，最后利用GOLD對接軟件篩選出可能的抑制物。Han等［26］則是通過表達、分離純化莽草酸脫氫酶，高通量篩選出五個可能是酶抑制劑的化合物。通過研究酶結構與活性的關系有助于抑制劑的開發(fā)，如 Cheng等［27］找到H.pylori莽草酸激酶結構中與莽草酸直接作用的重要保守殘基(D33、F48、R57、R116、R132)，并詳細分析酶催化活性位點的配體結合與構象柔性變化。

其他必需、非必需氨基酸的生物合成與代謝通路雖然通過基因組分析可以找到編碼大部分酶的相似基因，但還需通過進一步實驗證明。

圖2 H.pylori分支酸合成概略圖Fig.2 Chorismate synthesis pathway of H.pylori

2.3 維生素與輔因子的生物合成

甲基萘醌，即維生素K2，是作為病原菌呼吸鏈中電子轉運鏈的電子載體。大部分細菌都采用以大腸桿菌為模板的甲基萘醌生物合成通路，而Hiratsuka等［28］在鏈霉菌屬發(fā)現了一種新的甲基萘醌生物合成通路——Futalosine Pathway。Dairi［29］進一步證明了H.pylori采用Futalosine通路的變型通路，首先由mqnA編碼的酶介導生成AFL(6-amino-6-deoxyfutalosine)，繼而在甲基硫代腺苷核苷酶(Methylthioadenosine Nucleosidase，MTAN)作用下直接形成DHFL(dehypoxanthine futalosine)?；蚪M中找不到mqnA的相似基因，而HP0089編碼MTAN。MTAN是一種多功能酶，它位于7個基本細胞代謝通路的節(jié)點，包括甲基萘醌合成、甲硫氨酸補充途徑、S-腺苷甲硫氨酸利用、聚胺合成、嘌呤補充合成、S-腺苷甲硫氨酸自由基通路、II類自誘導分子合成，特異性的抑制 MTAN 活性可能抑制 H.pylori生長［30］。HpMTAN晶體結構中5’-烷基硫醇結合位點與底物(S-腺苷同型半胱氨酸)的相互作用特點可為發(fā)現MTAN抑制劑提供思路［30］。DHFL先后轉為cyclic DHFL、1，4-Dihydroxy-2-naphthoate，最后生成甲基萘醌［30］。H.pylori變型的 Futalosine通路的具體過程有待進一步研究。

生物素，也叫做維生素H，是所有生物體生長必不可少的輔因子。Lin等［31］提出大腸桿菌的生物素合成途徑如圖3所示，他們認為生物素合成途徑的開端模仿脂肪酸合成途徑。最后四步生成生物素的過程在所有生物體中保守，依次經過 BioF、BioA、BioD、BioB 的作用合成生物素［32］。在 H.pylori基因組中幾乎都找到了上述酶的相似基因(見圖3的括號內)，但針對H.pylori生物素合成通路的研究還很少。Przemyslaw等［33］純化了 HpBioD的結構，并與其他物種的BioD比較分析，總結出BioD的家族特點，提出該酶是抗菌藥物設計的新靶點。

圖3 大腸桿菌生物素合成通路Fig.3 Biotin synthesis of E.coli

維生素B6被公認為許多細胞代謝反應的輔因子，Grubman等［34］首次提出維生素B6與細菌致病機制密切相關。他們證明維生素B6對人類病原體的鞭毛結構、糖基化、運動能力具有重要作用，并找到H.pylori的兩個致病因子——HpPdxA和 HpP-dxJ，分別由HP1583和HP1582編碼。

2.4 核苷酸代謝

嘌呤和嘧啶是合成核苷三磷酸(NTPs)的基礎，是核酸的前體。H.pylori無法從頭合成嘌呤，而是通過補充途徑合成嘌呤。一方面，H.pylori的生長需要嘌呤(Abstract no.2273，Miller EF.＆ Maier RJ，Annual Meeting of the American Society for Microbiology，May 2011)，而生物信息學分析表明，嘌呤從頭合成第一步需要的IMP無法獲得，因為合成IMP需要10種酶，但基因組中只能找到兩種酶的相似基因(HP1218、HP1112)。另一方面，Liechti等［35］證實，H.pylori從環(huán)境中吸收原料，如:肌苷、腺苷、鳥嘌呤、鳥苷、黃嘌呤、黃苷，然后通過補充途徑合成IMP，IMP繼而分別生成ATP、GTP(見圖4)。補充途徑所需原料由HP1180編碼的轉運蛋白配合質子泵轉運至胞內［36］。HP0930編碼固定相生存蛋白，它將 GMP、XMP、IMP、AMP分別水解為相應的核苷［35］。之前的研究認為H.pylori存在腺嘌呤脫氨酶活性，但最新研究反駁了這一觀點，該酶的脫氨作用針對的是腺苷而不是腺嘌呤［36］，但基因組中沒找到對應的基因。

圖4 H.pylori嘌呤補充合成途徑概略圖Fig.4 Purine salvage pathway of H.pylori

UTP、CTP是RNA合成的前體，經9種酶從頭合成。暫時認為H.pylori嘧啶的從頭合成通路以大腸桿菌為模板，編碼這9種酶的相似基因依次是:HP0919/HP1237、HP1084、HP0581/HP0266、HP1011、HP1257、HP0005、HP0777、HP0198、HP0349。HP0777 編碼UMP激酶(UMPK)，而且與其他物種以Mg2+作為輔因子不同，它更傾向于把 Mn2+作為輔因子［37］。Chu等［38］進一步揭示GTP對HpUMPK的別構調節(jié)機制，GTP與HpUMPK結合成一個穩(wěn)定的六聚體，該齊聚反應狀態(tài)不易釋放產物UDP，但GTP結合的同時引發(fā)UDP結合區(qū)域(α2)變構而使緊密狀態(tài)松散，從而幫助釋放UDP。除了HP0777，其他酶-基因關系和脫氧核苷酸的生物合成途徑還沒有新的研究進展，故不贅述。

3 H.pylori其他特征

幽門螺旋桿菌的質子門控尿素通道即HpUREI是其能夠生存在胃酸性環(huán)境中的重要原因。Strugatsky等［39］揭示了幽門螺旋桿菌J99尿素的質子門控通道，這種六聚體結構是尿素及其他小酰胺溶質的新滲透模式的基礎。通道在中性pH條件下關閉，在酸性pH條件下打開，并允許尿素迅速進入細胞質與脲酶接觸。脲酶產生的NH3和CO2能夠中和進入胞內的質子，所以即使胃液pH低于2.0，細胞周質pH仍維持在6.1左右。HP0071是編碼該通道蛋白的相似基因。Cornally等［40］提出HP1193編碼的醛酮還原酶可能也與細菌適應酸環(huán)境生長有關。

H.pylori表達一種致病因子——CagA(cytotoxin-associated gene A)，CagA上調胃粘膜上皮細胞的精胺氧化酶水平［41］。精胺氧化酶分解精胺產生H2O2，從而導致細胞凋亡和DNA損傷。Lee等在H.pylori沒有檢測到精胺，而有亞精胺［42］。亞精胺由HP0832編碼的亞精胺合酶(spermidine synthase，SPMS)催化腐胺和脫羧的S-腺苷甲硫氨酸而生成，亞精胺合成通路是H.pylori聚胺的主要來源。HpSPMS與其他物種的SPMS序列相似性低于20%，而且缺少一段信號序列。晶體結構顯示HpSPMS有一個N端-beta折疊區(qū)和一個C端-羅斯曼樣結構域［43］，兩個結構域間有一個與眾不同的結合口袋，且酸性靜電表面電位較少，還有一個大的包藏空間，這些特點可能使HpSPMS成為潛在的抗菌藥物靶標，因為SPMS是菌體細胞保持活力必不可少的。雖然亞精胺合成通路的前幾個酶(speB、speC、speD)在基因組中沒找到，但是不能排除也像HpSPMS一樣序列相似性太低的情況。

4 總結與展望

全基因組尺度代謝網絡的構建，從系統(tǒng)的角度，由生物體內各種分子的相互作用的研究到代謝通路、網絡、模塊，最終對整個生命活動的路線圖有了完整的理解，進而對生物代謝功能進行重新設計和合理的工程改造。代謝網絡模型重構過程非常復雜，尤其是基因-蛋白質-反應關系的鑒別、網絡模型的評估驗證等步驟工作量大，耗費時間長。利用代謝網絡重構工具［44］可以縮短一定時間，提高工作效率，但構建高精度代謝網絡仍離不開大量人工驗證工作。一般先利用生物數據庫或軟件對代謝網絡進行初步重構，再根據生物文獻和生物實驗數據對初步重構的生物代謝網絡模型進行驗證和修正。目前H.pylori代謝網絡模型對必需基因的預測準確性不高，重構更加連續(xù)、完整的高精度模型是最終目標。

本文對H.pylori特異性的重要代謝通路進行了較為全面的綜述，一方面，從基因水平闡述代謝通路與基因的關系，為重構更高質量代謝網絡提供參考;另一方面，本文詳細分析了關鍵酶對H.pylori生理的重要作用，為開發(fā)抗幽門螺桿菌藥物、診斷幽門螺桿菌感染情況帶來啟示。H.pylori代謝網絡大部分是保守的，多采用與大腸桿菌或其他近緣物種非常相似的代謝形式，然而，在進化過程中一部分H.pylori特異性的代謝過程對實際應用具有更大價值。生物體的代謝過程與轉錄調控、信號轉導機制密切相關，為了更加精確地做出預測，更加真實地模擬生物體生命活動的路線圖，需要在代謝網絡基礎上，整合轉錄調控網絡和信號轉導網絡。整合的H.pylori調控網絡、信號網絡和代謝網絡模型將是未來的一個研究方向。

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