基于Bioperl實現(xiàn)遠程自動獲取抗逆基因序列

張曉婧，潘偉民，曹興芹

(新疆師范大學生命科學學院，新疆烏魯木齊830054)

Perl語言是所有編程語言中最擅長文字處理的語言［1］，BioPerl不僅具有 Perl語言的所有優(yōu)點，而且此模塊中還包含大量獲取分析生物數據的小模塊，對于現(xiàn)在的研究者來說，不論是在生物領域還是計算機科學領域，都是一個非常棒的工具。

近幾年來，關于抗逆基因的研究越來越受研究者們的關注，無論對于惡劣環(huán)境地區(qū)植物的生長，還是對于動植物抗病害來說，都是非常重要的。一般情況下，想要獲取全面準確的抗逆基因數據，現(xiàn)行的方法只有手動去NCBI搜索或者手工記錄(例如:DRASTIC INSIGHTS網站中的抗逆基因數據都是通過手工記錄搜集的［2］)，一般搜索出的數據都是幾萬條，甚至幾十萬條，這其中大部分還不符合條件，需費時去篩選，最后才能下載，是一件耗時又耗力的工作;而對于需要搭建生物抗逆基因二次數據庫的項目來說［3］，這又是必須要實現(xiàn)的前提，只有保證數據源全面準確，才可稱為有價值的二次數據庫。目前也有類似解決這個問題的研究［4－6］，但并沒有達到很好的效果。

相比之下，利用 BioPerl使用 NCBI提供的 EUtilities編程接口，全面結合抗逆基因關鍵詞來編寫的程序，可以快速有效地遠程自動獲取抗逆基因，數據比較全面準確。在程序方法設計時，以LEA基因為例(其他抗逆基因類似，只需將對應的關鍵詞換掉即可)。

1 程序設計

1.1 程序運行環(huán)境

程序環(huán)境:Windows XP+ActivePerl5.16.1 Build+BioPerl 1.6.1，以上的安裝配置均參照BioPerl網站中 Installing BioPerl on Windows文件［7］。

1.2 關鍵詞的篩選

關鍵詞即本程序的檢索條件，為了獲得更全面、更準確的序列，一定要篩選出最合適、最全面的關鍵詞。首先得到的關鍵詞，是從抗逆基因的定義及特征中總結出的，共10個，2012年白琳的碩士學位論文《植物抗逆基因資源平臺的構建與分析》中也提到了這幾個關鍵詞［6］，證明此處關鍵詞的準確性;其次，在大量的抗逆基因文獻中［8－9］，提取出了較完整的抗逆基因種類，從中可以總結出所有抗逆基因種類直接描述的關鍵詞，共29個，可靠性可以得到保證;最后是關于LEA基因的關鍵詞，現(xiàn)今對LEA基因的研究越來越多，相關文獻也涌現(xiàn)出許多，在這些文獻中將LEA基因家族進行分類［10－11］，其中有兩個LEA 基因族，文獻中有提到過它們的別名，即LEA2族也被稱作dehydrin(脫水素)，LEA4族也被稱作seed maturation protein，由此又得到兩個關鍵詞，且這兩個關鍵詞在LEA基因序列中也得到驗證，如 AF031248.1、AY044271.1等。具體關鍵詞列表(見表1)。

表1 關鍵詞列表Table 1 Keywords list

1.3 程序方法設計

LEA蛋白基因(late embryogenesis abundant proteins，LEA)是一類具有重要抗逆功能的抗逆基因，特別是在抗干旱、高鹽、高溫等環(huán)境脅迫方面顯示出強大的保護功能［10－11］。程序以LEA基因為例，源代碼見圖1。

圖1 程序代碼Fig.1 The code of program

程序具體實現(xiàn)過程如下:第一步，調用esearch服務端程序，此服務端程序的作用是可以根據給定條件來查詢序列［12］，這里用“LEA［ALL］OR late embryogenesis abundant proteins［ALL］OR dehydrin［ALL］OR seed maturation protein［ALL］AND 0:3000［SLEN］”作為關鍵詞條件，“0:3000［SLEN］”這個條件將檢索范圍縮小到長度為0～3 000 bp的序列，由于esearch只能進行檢索序列的工作，而不具有下載功能，所以在程序后半部分需要用到另一個服務端程序efetch。第二步，在用efetch程序之前，需要一個中間變量，儲存上一步的檢索數據，為下一步提供下載的原始記錄，這里先將esearch程序中“－usehistory”參數設為“y”［13］，保存歷史瀏覽記錄(注意這里只是緩存數據，并沒有直接下載到本地)，將歷史瀏覽數據賦值給中間變量$hist，為下步做好準備;第三步，用到efetch服務端程序，將歷史數據以‘genbank’格式下載到本地。

2 結果與討論

2.1 程序結果

本文設計的程序為實現(xiàn)遠程自動獲取大量基因序列提供了一種較好的解決辦法。程序在Windows XP平臺下經測試運行穩(wěn)定，跨平臺移植性好。該程序從 NCBI中獲取 LEA基因序列共47 061條(3 000 bps以內的序列)，截止2013年11月12日。

此程序將遠程獲取的序列數據存儲到‘leakeyword.gb’文件中，在這里可以注意到本文程序可以大量自動下載到‘genbank’格式文件，而以往在BioPerl中用到E-Utilities這個接口時，只能大量下載到‘fasta’或‘xml’格式的文件，要下載‘genbank’格式文件只能是小量下載(即給定gi號來下載)，筆者也曾試過用下‘fasta’格式文件的方法來下載‘genbank’格式文件，雖然是下載成功了，可是‘genbank’文件中的結構已經完全不同了(見圖2)，內容雖然完整，可是格式完全變了，作為數據庫的源數據是不可能的，fasta格式中又不包含特征表的內容，而xml格式更不適合，白琳的碩士學位論文《植物抗逆基因資源平臺的構建與分析》中［6］，下載到的便是xml格式文件，她之后還需要從中提取出gi號，再根據這個下載‘genbank’格式文件，程序變得很復雜。所以本文的程序至少有兩點好處:一是打破以往只能小量下載‘genbank’文件的限制，二是不需要中間轉換程序，便捷、靈巧。

圖2 Genbank文件Fig.2 Genbank document

本程序中用到的關鍵詞條件，是目前查詢條件中較全面、準確的條件，不僅涵蓋了表面意思中得到的關鍵詞，還考慮到基因本身功能及基因分類之后的別名，使得自動獲取的抗逆基因更加全面、準確，為生物二次數據庫的構建打好了堅實的基礎。

2.2 討 論

2009年5月，NCBI創(chuàng)建了Eutilities編程接口之后，BioPerl便添加了Bio::DB::Eutilities對象包，此對象包可以使Perl調用Eutilities所包含的所有功能，可遠程操作NCBI中的序列數據，為生物信息學的發(fā)展帶來了福音。Eutilities包括8個服務端程序:efetch、esearch、einfo、egquery、esummary、elink、espell、epost［13］，這 些 服 務 端 程 序 不 僅 可 以 檢 索NCBI數據庫，從中遠程下載序列，還可以向數據庫提交序列，返回序列中所有相關數據庫信息等，并且還可以檢索PubMed數據庫，大家都知道PubMed數據庫中的信息量非常龐大，且具有很高的利用價值，但卻不容易提取出來，Eutilities為它提供了可能性。同時，Perl語言是最強大的文本處理程序語言，有這兩者的結合，相信不久的將來PubMed中的數據也能被廣泛的利用。

利用BioPerl可以處理大部分序列分析的工作，例如它可以讀取大量的序列格式，F(xiàn)asta、Genbank、EMBL、PIR、GCG等，可以遠程獲取序列數據，不僅免去了格式轉化的麻煩，還解決了手工獲取序列時費時費勁的不便。且Bio::SeqIO對象包不僅能讀取多種格式，包括 Fasta、EMBL、GenBank、PIR、Swissprot、GCG、SCF、phd/phred、Ace、fastq、exp、chado以及raw(plainsequence)等，還可以閱讀一個大文件(其中包含許多序列信息)，將其中每條序列信息讀出，對于分析生物數據來說解決了許多費時費力的工作。

3 結束語

雖然本文程序解決了遠程自動獲取大量序列的問題，但是由于使用關鍵詞來作為檢索條件，還是屬于模糊查詢范疇，在下載的結果中，或多或少會存在一些不太正確的序列，這并不是關鍵詞的問題，因為關鍵詞只是一類序列的簡單描述，并沒有從深層面去考慮序列的特征，例如我們也許可以從序列的特征表出發(fā)，應該可以做到精確查詢。還有一點就是，本文程序查詢的數據庫比較單一，如果以后能將PubMed文獻數據庫加以利用［14］，一定能比現(xiàn)在達到更好的效果。

BioPerl一直以來都是生物信息學家的首選工具，它不僅具有上文所說的序列格式轉化功能、遠程下載功能，并且BioPerl還能識別限制性酶切位點，可分析blast的結果，可操作系統(tǒng)發(fā)育樹等等，大部分在生物中要需要分析的功能，基本上都包含了。再加上Bio::DB::Eutilities對象包，對于BioPerl來說真是如虎添翼，這些在很大程度上，推動了生物信息學這門新興交叉學科的發(fā)展，并為這門學科做出了很卓越的貢獻，是人們在研究這塊領域時，首先選擇的工具。

References)

［1］ TOM P.Perl語言入門(第六版)［M］.盛春譯.江蘇:東南大學出版社，2012:130－179.TOM P.Introduction to the Perl language［M］.SHENG Chun.Jiangsu:Southeast university press，2012:130 －179.

［2］ Gary L.Drastic insights［EB/OL］.http://www.drastic.org.uk/，2014 －6 －16.

［3］ 邢仲璋，林王源，林毅申.基于bioperl的生物二次數據庫建立及應用［J］.計算機系統(tǒng)應用，2004，11(11):58 －60.XING Zhongzhang，LIN Wangyuan，LIN Yishen.Based on the bioperl biological secondary database establishment and the application［J］. The Computer System Application，2004，11(11):58 －60.

［4］ 向福，余龍江，栗茂騰.用 bioperl實現(xiàn)種子植物18srRNA基因序列的大規(guī)模獲?。跩］.華中農業(yè)大學學報，2005，24(4):330 －333.XIANG Fu，YU Longjiang，JIA Maoteng.By bioperl implementation of seed plant large-scale access srrna gene sequences of 18［J］.Journal of Huazhong Agricultural University，2005，24(4):330 －333.

［5］ 向福，余龍江，陳悟.基于Bioperl的基因序列獲取的程序設計與實現(xiàn)［J］.生物技術，2004，14(6):64 －66.XIANG Fu，YU Longjiang，CHEN Wu.Based on the bioperl gene sequence for program design and implementation［J］.Biotechnology，2004，14(6):64 －66.

［6］ 白琳.植物抗逆基因資源平臺的構建與分析［D］.浙江:浙江大學生命科學學院，2012:7－9.BAI Lin.Plants to genetic resources platform construction and analysis［D］.Zhejiang:Zhejiang University College of Life Science，2012:7 －9.

［7］ BioPerl.Installation［EB/OL］.http://www.bioperl.org/wiki/Installing_BioPerl，2014 －4 －19.

［8］ 高銀.植物抗逆機制與基因工程研究進展［J］.內蒙古農業(yè)科技，2007，6(5):75 －78.GAO Yin.Plants to mechanisms and gene engineering are reviewed［J］.Inner Mongolia Agricultural Science and Technology，2007，6(5):75 －78.

［9］ 楊柳，張振乾，宋繼金.植物抗逆基因研究進展［J］.作物研究，2010，4(1):126 －129.YANG Liu，ZHANG Zhenqian，SONG Jijin.Plants gene research progress［J］.Crop Research，2010，4(1):126 －129.

［10］李樂，許紅亮，楊興露.大豆 LEA基因家族全基因組鑒定、分類和表達［J］.中國農業(yè)科學，2011，5(5):3945－3954.LI Le，XU Hongliang，YANG Xinglu.Soybean LEA gene families genome-wide identification，classification and expression［J］.Scientia Agricultural Sinica，2011，5(5):3945－3954.

［11］白永琴，楊青川.LEA蛋白研究進展［J］.生物技術通報，2009，9(9):1 －5.BAI Yongqin，YANG Qingchuan.LEA proteins is reviewed［J］.Biological Technical Bulletin，2009，9(9):1 －5.

［12］夏武青，葛芬，宋霞.基于 NCBI開放編程接口的局域網PubMed檢索平臺設計與實現(xiàn)［J］.中華醫(yī)學圖書情報雜志，2012，21(8):66 －69.XIA Wuqing，GE Fen，SONG Xia.Local area network(LAN)based on NCBI open programming interfaces PubMed retrieval platform design and implementation［J］.The Chinese Medicine Books Intelligence Magazine，2012，21(8):66 －69.

［13］許丹，朱斐.從PubMed數據庫中挖掘生物醫(yī)學中的十大熱點話題［J］.計算機與現(xiàn)代化，2013，1(1):192 －199.XU Dan，ZHU Fei.In the biomedical PubMed database mining top ten hot topic［J］.Computer and Modern，2013，1(1):192 －199.

［14］PHILIPPE T，JOHANNES S，ALEXANDER V.GeneV-iew［J］.Nucleic Acids Research，2012，6(6):585 －591.