有機(jī)小分子與DNA相互作用的研究手段進(jìn)展

陳駿 ，施介華 ，2

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310012；2.浙江工業(yè)大學(xué)綠色化學(xué)合成技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江杭州 310032）

脫氧核糖核酸（DNA）是人體中最為重要的生物大分子，是生命的基礎(chǔ)。DNA通過(guò)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯形成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)通過(guò)直接參與生物體內(nèi)的催化、免疫、代謝過(guò)程，物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，信息傳遞以及運(yùn)動(dòng)和生物調(diào)控來(lái)協(xié)調(diào)人體的生命過(guò)程。而隨著化學(xué)工業(yè)的發(fā)展，不經(jīng)合理排放的印染廢水［1］，濫用的農(nóng)藥［2］以及工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的有毒氣體、有毒物質(zhì)中的有機(jī)小分子有可能會(huì)直接或者間接地對(duì)DNA造成損傷，從而致畸致癌致突變［3］。同時(shí)，Laureen C.Colis［4］發(fā)現(xiàn)一種由海洋細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)小分子lomaiviticin A能夠通過(guò)破壞DNA的方式來(lái)殺滅癌細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)或許可以為新型化療藥物的開發(fā)鋪平道路。因此，研究有機(jī)小分子與DNA相互作用的過(guò)程有助于明確有機(jī)小分子是否存在致癌作用以及具體的致癌機(jī)理，并為癌癥的預(yù)防，綠色化合物的設(shè)計(jì)等提供理論基礎(chǔ)。在科研實(shí)驗(yàn)中，由于人體DNA不易提取和保存，因此常用同源性非常高的小牛胸腺DNA （ct－DNA）來(lái)替代人體DNA。本文概述了有機(jī)小分子與DNA的結(jié)合模式及表征手段，并介紹了分子模擬在這一方面的應(yīng)用。

1 有機(jī)小分子與DNA結(jié)合的模式

有機(jī)小分子與DNA之間的結(jié)合方式主要包括共價(jià)結(jié)合與非共價(jià)結(jié)合。其中共價(jià)結(jié)合［5］是指靶向化合物與DNA中的堿基、糖和磷酸酯鍵形成共價(jià)鍵，主要表現(xiàn)為DNA的烷基化、DNA的鏈間交聯(lián)和DNA的鏈內(nèi)交聯(lián)，例如作為雙功能烷化劑的環(huán)磷酰胺即能通過(guò)鏈內(nèi)交聯(lián)的方式與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，從而能夠抑制DNA的合成。大多數(shù)的有機(jī)小分子與DNA的結(jié)合方式是非共價(jià)結(jié)合，而非共價(jià)結(jié)合［6］主要包括三類（靜電作用、溝區(qū)結(jié)合、嵌入結(jié)合），如圖1所示。靜電作用是指有機(jī)小分子能與DNA的磷酸根基團(tuán)相互作用，這種作用主要結(jié)合于DNA的外壁，常與溝區(qū)結(jié)合和嵌入結(jié)合方式同時(shí)并存，以起到輔助的結(jié)合作用，其本身沒(méi)有特異性。溝區(qū)結(jié)合是指有機(jī)小分子通過(guò)范德華力與氫鍵作用與DNA溝區(qū)的A－T結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，有機(jī)小分子通常結(jié)合于DNA的小溝區(qū)。嵌入結(jié)合是指一個(gè)分子的平面稠環(huán)部分嵌入到DNA的兩個(gè)堆積的堿基對(duì)之間，其作用力主要是π－π＊共軛作用及疏水作用，嵌入結(jié)合相對(duì)于溝區(qū)結(jié)合方式最大的特點(diǎn)在于其會(huì)使DNA的構(gòu)象發(fā)生變化，從而使DNA不能輕易地復(fù)制而產(chǎn)生抗病毒抗腫瘤的作用，但由于嵌入作用會(huì)損害DNA的構(gòu)象，因此嵌入結(jié)合同時(shí)也被看作是一種致癌的因素。

圖1 有機(jī)小分子與DNA的不同結(jié)合模式

2 表征手段

2.1 紫外光譜法

紫外光譜法是研究有機(jī)小分子與DNA相互作用最為常用的一種方法，它能夠快速地檢測(cè)出隨著DNA濃度變化時(shí)有機(jī)小分子可能會(huì)發(fā)生的變化。嵌入作用會(huì)使配體與堿基對(duì)產(chǎn)生π電子堆積，使能量下降，產(chǎn)生紅移效應(yīng)；同時(shí)，耦合后的π＊軌道因部分填充電子，使π－π＊躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng)，因此紅移減色效應(yīng)為嵌入結(jié)合的特征之一［7］。而當(dāng)藥物小分子與DNA以溝區(qū)結(jié)合作用的時(shí)候，只會(huì)出現(xiàn)減色效應(yīng)而不會(huì)出現(xiàn)紅移效應(yīng)，出現(xiàn)減色效應(yīng)的原因可能是藥物小分子的發(fā)色團(tuán)被DNA的含氮堿基所覆蓋導(dǎo)致。Nahid Shahabadi［8］在運(yùn)用紫外光譜法研究中性紅（NR）與ct－DNA的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)中性紅在464 nm處發(fā)生減色紅移效應(yīng)，從而驗(yàn)證了中性紅與ct－DNA的相互作用是嵌入結(jié)合作用。

2.2 熒光光譜法

由于熒光光譜法較紫外光譜法的靈敏度更加高，且不易受到環(huán)境的干擾，因此熒光光譜法是研究有機(jī)小分子與DNA相互作用的重要手段，目前被廣泛應(yīng)用于科研工作中。

DNA自身的熒光很弱，不適合直接觀察DNA熒光強(qiáng)度的變化情況，如果有機(jī)小分子本身具有熒光特性，可根據(jù)加入DNA前后有機(jī)小分子的發(fā)射光譜圖的變化來(lái)研究有機(jī)小分子與DNA相互作用的過(guò)程，并能據(jù)此得到二者之間的結(jié)合常數(shù)。如果有機(jī)小分子的熒光效率也很低，那么必須借助于熒光探針如經(jīng)典的嵌入結(jié)合探針溴化乙錠（EB）、溝區(qū)結(jié)合探針Hoechst－33258來(lái)觀察有機(jī)小分子與DNA的結(jié)合情況。EB含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)，而Hoechst－33258結(jié)合于DNA的AATC位點(diǎn)。在研究有機(jī)小分子與DNA的作用中，常常使用EB［9］、Hoechst－33258［10］作為 DNA 的分子探針，這是因?yàn)樗鼈兣cDNA結(jié)合后能夠使熒光增強(qiáng)，若有機(jī)小分子嵌入結(jié)合于DNA中，則會(huì)使DNA－EB中的部分 EB被競(jìng)爭(zhēng)游離出，因此DNA－EB復(fù)合物的濃度降低，其熒光強(qiáng)度相應(yīng)降低。若有機(jī)小分子結(jié)合于DNA的A－T溝區(qū)結(jié)合位點(diǎn)，會(huì)與Hoechst－33258產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，使熒光強(qiáng)度降低。這同時(shí)也是一種判斷有機(jī)小分子與DNA結(jié)合方式的一種手段。Soheila Kashanian［11］等人利用氟西汀自身的熒光特性通過(guò)熒光光譜法得到氟西汀溝區(qū)結(jié)合于ct－DNA。而由于左拉乙西坦與DNA的熒光特性都很弱，因此需要使用到熒光探針。Nahid Shahabadi［12］等人發(fā)現(xiàn)隨著左拉乙西坦?jié)舛鹊脑龈?，DNA－Hoechst 33258復(fù)合物的熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明左拉乙西坦與Hoechst 33258競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于DNA。

2.3 圓二色光譜法

圓二色性是指物質(zhì)對(duì)左旋圓偏振光與右旋圓偏振光吸收率不同所表現(xiàn)出的性質(zhì)，圓二色譜是研究生物大分子構(gòu)象的強(qiáng)有力的工具。

DNA是有旋光性的生物大分子，B型DNA的特征圓二色譜峰在 209、221、245、275 nm［13］；DNA在275 nm的時(shí)候呈現(xiàn)的是因?yàn)閴A基堆積造成的正峰，245 nm處的負(fù)峰是由于雙螺旋結(jié)構(gòu)造成。通過(guò)觀察位于245 nm、275 nm處的峰位置與峰強(qiáng)度的變化，可判斷出有機(jī)小分子與DNA的作用方式。Xiangyu Xu［14］等人應(yīng)用圓二色光譜法研究了氟尿嘧啶、喃氟啶與ct－DNA的相互作用。結(jié)果表明，ct－DNA在245 nm、275 nm處的負(fù)峰和正峰發(fā)生了輕微的位移，并且245nm處峰強(qiáng)度減弱，表明氟尿嘧啶、喃氟啶對(duì)ct－DNA的構(gòu)象產(chǎn)生了明顯的影響，275 nm處的峰強(qiáng)度減弱表明堿基堆積作用減弱。

2.4 紅外光譜法

紅外光譜是研究分子運(yùn)動(dòng)的吸收光譜，它可以用于化合物分子結(jié)構(gòu)的測(cè)定、未知物的鑒定以及混合物成分的分析。通過(guò)紅外光譜法分析DNA－有機(jī)小分子體系中混合物成分的變化情況，可以判斷DNA與有機(jī)小分子的結(jié)合作用方式。DNA［15］在 1710 cm－1、1662 cm－1、1613 cm－1、1492 cm－1的面內(nèi)振動(dòng)分別歸屬于 G、T、A、C，1226 cm－1歸屬于PO2的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1088 cm－1歸屬于PO2的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，834、936 cm－1的峰歸屬于 B型DNA的構(gòu)型特征峰，若是溝區(qū)結(jié)合，則在1662 cm－1與1610 cm－1處的峰位置和峰強(qiáng)度會(huì)有相應(yīng)的變化。另外觀察磷酸根離子在1226 cm－1與1088 cm－1處的吸收峰位置與強(qiáng)度的變化，可判斷是否存在靜電結(jié)合作用，觀察834、936 cm－1的峰位置與峰強(qiáng)度的變化，可以推斷DNA的構(gòu)型是否發(fā)生了變化。Guowen Zhang［16］等對(duì)比芍藥苷加入前后DNA紅外光譜圖譜的變化，發(fā)現(xiàn)歸屬于胸腺嘧啶的1662 cm－1和歸屬于腺嘌呤的 1613 cm－1分別藍(lán)移到 1656 cm－1和 1609 cm－1， 而這兩個(gè)峰的峰強(qiáng)度增強(qiáng)，表明芍藥苷直接結(jié)合于腺嘌呤（N7）與胸腺嘧啶（O2），歸屬于鳥嘌呤、胞嘧啶和磷酸根離子處的吸收峰并沒(méi)有發(fā)生變化，表明不存在靜電結(jié)合作用，芍藥苷也沒(méi)有與鳥嘌呤、胞嘧啶相互作用，此外，834、 936 cm－1并沒(méi)有變化，表明DNA的構(gòu)象沒(méi)有受到影響。

2.5 粘度法

粘度法因其操作簡(jiǎn)單、造價(jià)低廉、結(jié)果易得的特點(diǎn)使得它常常作為研究藥物分子與DNA結(jié)合方式的輔助手段。有機(jī)小分子以嵌入方式作用DNA時(shí)，會(huì)使堿基對(duì)的距離增加，粘度系數(shù)增加，使溶液的粘度增加；有機(jī)小分子以非嵌入方式作用于DNA時(shí)，對(duì)溶液的粘度影響不大；而當(dāng)有機(jī)小分子以部分嵌入方式作用于DNA時(shí)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重扭曲，從而使得粘度減小。粘度法常常作為驗(yàn)證DNA與藥物結(jié)合方式的手段而被使用。白菊［17］等人利用粘度法研究了GD（III）－EBBR配合物與鯡魚精子DNA的作用方式，結(jié)果加入GD （III）－EBBR配合物后DNA的粘度減小，表明GD（III）－EBBR配合物以部分嵌入結(jié)合作用于DNA。

2.6 電化學(xué)方法

電化學(xué)方法也常常被用于作為研究有機(jī)小分子與DNA相互作用的一種方法，其中循環(huán)伏安法最為常用。有機(jī)小分子與DNA結(jié)合之后，會(huì)表現(xiàn)在循環(huán)曲線所得的式量電位的移動(dòng)，當(dāng)電活性的分子式量電位正移時(shí)，代表有機(jī)小分子嵌入于DNA，式量電位負(fù)移代表有機(jī)小分子靜電結(jié)合于DNA，若式量電位不發(fā)生移動(dòng)，代表有機(jī)小分子與DNA 以溝區(qū)模式相結(jié)合［18］。劉偉［19］等人設(shè)計(jì)合成了 3，5－二碘水楊醛縮 4，4’－二氨基二苯甲烷雙席夫堿的 Cu（Ⅱ）和 Mn（Ⅱ）的配合物，并用循環(huán)伏安法表征了兩種配合物與DNA的結(jié)合模式。結(jié)果表明，兩種配合物的氧化峰點(diǎn)位均發(fā)生了不同程度的正移，且峰電流減少，表明兩種配合物以嵌入結(jié)合與DNA鍵合，使得單位時(shí)間內(nèi)遷移到電極表面的配合物分子數(shù)量減少。

3 分子模擬

利用計(jì)算機(jī)輔助觀察有機(jī)小分子與DNA之間的相互作用，在近幾年來(lái)發(fā)展得十分迅速，特別是DNA大分子數(shù)據(jù)庫(kù)的建立更加促進(jìn)了分子模擬的發(fā)展。分子對(duì)接是計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的一種方法，通過(guò)分子對(duì)接可以直觀地觀察到有機(jī)小分子與DNA的結(jié)合方式，并用以支持實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，有助于從原子水平上了解有機(jī)小分子與DNA的作用方式。分子對(duì)接根據(jù)體系中分子構(gòu)象的變化可以分為三種：柔性對(duì)接、半柔性對(duì)接和剛性對(duì)接。在柔性對(duì)接方式下，體系中所有分子的構(gòu)象都可以自由地變化，這種對(duì)接方式所耗費(fèi)的時(shí)間很長(zhǎng)。半柔性對(duì)接允許體系中的分子（特別指配體）在一定的范圍內(nèi)活動(dòng)，使用這種方式進(jìn)行對(duì)接時(shí)，一般是固定大分子的構(gòu)象，變化小分子的構(gòu)象，這種對(duì)接方式也是目前常用的一種對(duì)接方式。剛性對(duì)接是指體系中的分子的構(gòu)象都是固定不變的，這種對(duì)接方式比較適合于大的體系，例如蛋白與核酸之間的對(duì)接。作為半柔性對(duì)接軟件中的代表，開源軟件Autodock在有機(jī)小分子與DNA相互作用的研究中應(yīng)用得十分廣泛。Autodock［20］采用的機(jī)理是固定大分子的構(gòu)象，讓有機(jī)小分子在設(shè)置的合理區(qū)域里與大分子構(gòu)象進(jìn)行匹配，采用拉馬克遺傳算法與模擬退火相結(jié)合的方式來(lái)獲取有機(jī)小分子與生物大分子一系列具有合理構(gòu)象的復(fù)合物，并使用打分函數(shù)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行打分，根據(jù)得到的最低結(jié)合自由能即能夠篩選出最穩(wěn)定的復(fù)合物，從而得到結(jié)合位點(diǎn)以及氫鍵等信息。

Sonika Charak［21］等人使用 Autodock 軟件對(duì)瘤可寧與DNA之間的結(jié)合信息進(jìn)行探討，在進(jìn)行了100次運(yùn)算之后得到瘤可寧溝區(qū)結(jié)合于DNA，且瘤可寧的O18、O19與鳥嘌呤的N2發(fā)生了氫鍵結(jié)合，計(jì)算得到的結(jié)合結(jié)果與從紅外光譜上得到的結(jié)果一致。另外，計(jì)算得到的吉布斯自由能為－5.91 kcal／mol，而通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的吉布斯自由能為－4.2 kcal／mol， 計(jì)算得到的結(jié)果和實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果也較為匹配。Yocheved Gilad［22］等人用Autodock軟件將63種DNA嵌入結(jié)合的有機(jī)小分子進(jìn)行對(duì)接以驗(yàn)證結(jié)合模式，結(jié)果證明Autodock軟件能夠有效地區(qū)分溝區(qū)結(jié)合模式和嵌入結(jié)合模式，證明了Autodock軟件在辨別有機(jī)小分子與DNA結(jié)合模式上的可靠性。另外，將Autodock軟件與分子三維結(jié)構(gòu)處理軟件結(jié)合在一起使用，可以快速、準(zhǔn)確、直觀地處理大批量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Daniel Seeliger［23］等人將 PyMOL插件安裝到Autodock軟件上，不僅保存了原有的Autodock軟件功能，同時(shí)在對(duì)接的準(zhǔn)備，運(yùn)行以及結(jié)果分析上增加了額外的如3D可視化、虛擬篩選分析等功能，這簡(jiǎn)化了Autodock軟件的操作，并豐富了Autodock軟件的功能運(yùn)行。

4 展望

相對(duì)于利用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法去研究有機(jī)小分子與DNA的相互作用，利用分子模擬更加方便、快捷，并且節(jié)省實(shí)驗(yàn)資源，同時(shí)能夠大批量地進(jìn)行研究總結(jié)，從而找出實(shí)驗(yàn)規(guī)律，為設(shè)計(jì)低毒性的化學(xué)分子提供理論基礎(chǔ)。因此，在未來(lái)，隨著研究的深入以及大分子數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)充，分子模擬必將替代傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法，成為主流的科研手段。

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