苯妥英鈉對慢性高眼壓兔視神經(jīng)的保護(hù)作用

王心淼 崇曉霞 陳曄

青光眼是一組嚴(yán)重威脅視神經(jīng)功能的眼病，2000年全球約有670萬患者因青光眼致盲［1］。目前青光眼的發(fā)病機(jī)制并未完全明確，高眼壓一直被認(rèn)為是引起青光眼視神經(jīng)損害的重要機(jī)制，因而目前治療青光眼的主要手段就是降低眼壓，然而部分患者眼壓降至正常后視功能還發(fā)生進(jìn)一步損害［2-3］，說明高眼壓并不是導(dǎo)致青光眼視神經(jīng)損害的唯一病因。近年來有研究發(fā)現(xiàn)青光眼患者視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(ratinal ganglion cell，RGC)發(fā)生選擇性損傷，且這種選擇性損傷是以細(xì)胞凋亡為主要特征的［4］。而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死(凋亡)的一個重要因素就是細(xì)胞內(nèi)異常的Na+內(nèi)流，因而Na+通道阻滯劑能夠減少神經(jīng)軸突的二次損傷并增加損傷的修復(fù)［5］。

抗驚厥藥物苯妥英鈉(Na+通道阻滯劑)為二苯乙內(nèi)酰脲的鈉鹽，對各種組織的可興奮膜，包括神經(jīng)元和心肌細(xì)胞膜有穩(wěn)定作用，而對正常的低頻度放電并無明顯影響。國外已有文獻(xiàn)報(bào)道苯妥英鈉對動物中樞神經(jīng)損傷有保護(hù)作用［6］。我們通過研究苯妥英鈉對青光眼視神經(jīng)細(xì)胞的影響來觀察此藥物是否能夠阻止或延緩其凋亡過程，為證明苯妥英鈉具有保護(hù)視神經(jīng)的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 成年新西蘭大白兔30只，雌雄不限(由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)，體質(zhì)量2.5～3.0 kg。苯妥英鈉片(山西汾河制藥有限公司，每片50 mg)。

1.2 方法

1.2.1 模型的制作 速眠新注射液(長春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn))0.1 mL·kg－1兔耳緣靜脈注射，待麻醉固定后每眼通過1 mL注射器切口抽取房水0.1 mL，隨后注射等量的 3 g·L－1復(fù)方卡波姆溶液［7］，術(shù)畢紅霉素眼膏涂眼。

1.2.2 動物分組 將30只大白兔隨機(jī)分為高眼壓組、高眼壓治療組與正常眼壓組(每組各10只)。高眼壓治療組于高眼壓造模前3 d［8］開始苯妥英鈉懸液灌胃，劑量為 30 mg·kg－1［9］，每天 1 次，持續(xù) 4周，高眼壓組僅制作高眼壓模型，正常眼壓組不作任何處理。

1.2.3 眼壓測量 固定動物，5 g·L－1地卡因滴眼3次，用眼壓計(jì)(蘇州醫(yī)療器械廠生產(chǎn))測量眼壓，術(shù)后每天1次，每次取3個有效測量值的平均值為結(jié)果，1周后每周測 3次，如眼壓低于 28 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，則用上述方法調(diào)整。

1.2.4 RGC及視網(wǎng)膜標(biāo)本制作及觀察 高眼壓術(shù)后4周時，以氣體栓塞法處死兔，摘取眼球，并在6點(diǎn)鐘位角膜緣縫線標(biāo)記，中性甲醛固定，常規(guī)酒精梯度脫水，平行于視神經(jīng)縱行剖開眼球，二甲苯透明、浸蠟、包埋。平行于眼球剖面做5 μm常規(guī)石蠟連續(xù)切片4張，HE染色前將組織切片在室溫下晾干2 h。常規(guī) HE染色，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。剩余2張采用TUNEL標(biāo)記凋亡細(xì)胞［10］，按南京凱基試劑盒說明步驟行TUNEL染色。陽性結(jié)果的判定以細(xì)胞核中可見到棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 圖像分析 眼球標(biāo)本選擇在視盤旁3 mm部位，隨機(jī)選擇每個切片的5個視野，行HE染色，并于高倍鏡下觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer，RNFL)厚度(內(nèi)界膜至節(jié)細(xì)胞層內(nèi)側(cè))。TUNEL染色后高倍鏡下觀察，RGC細(xì)胞計(jì)數(shù)采用在高倍鏡下(400倍)使用0.5網(wǎng)形目鏡尺計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜(62.5 μm2)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)，每個標(biāo)本計(jì)數(shù)5個視野，取其平均數(shù)，計(jì)算每100 μm2中 RGC凋亡細(xì)胞數(shù)和內(nèi)核層凋亡細(xì)胞數(shù)，作為后視網(wǎng)膜產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的定量指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行方差分析，采用 SNK-t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常眼壓組、高眼壓組與高眼壓治療組實(shí)驗(yàn)前后眼壓變化 實(shí)驗(yàn)前各組眼壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)，各時間點(diǎn)正常眼壓組眼壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.42)。高眼壓組和高眼壓治療組術(shù)后1 d眼壓即升高，1周眼壓持續(xù)升高，術(shù)后2周及3周兔眼壓略有下降，但始終＞25 mmHg，完全符合持續(xù)性高眼壓標(biāo)準(zhǔn)［11］，高眼壓一直持續(xù)至實(shí)驗(yàn)中止，實(shí)驗(yàn)后各時間點(diǎn)高眼壓組、高眼壓治療組與正常眼壓組眼壓差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.05)，高眼壓組與高眼壓治療組之間眼壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.88)。

表1 高眼壓組、高眼壓治療組與正常眼壓組實(shí)驗(yàn)前后眼壓值比較Table 1 Comparison of intraocular pressure among normal group，OH group and OH+phenytoin group before and after experiments (P/mmHg)

2.2 高眼壓組和高眼壓治療組造模后眼表大體形態(tài)觀察 高眼壓組和高眼壓治療組裂隙燈下觀察兔右眼注射復(fù)方卡波姆液后3 h出現(xiàn)睫狀充血、角膜水腫、瞳孔散大等高眼壓體征。

2.3 術(shù)后4周高眼壓組、高眼壓治療組與正常眼壓組視網(wǎng)膜形態(tài)比較

2.3.1 HE染色結(jié)果 正常眼壓組視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，可觀察到10層結(jié)構(gòu)，外核層細(xì)胞數(shù)量最多，內(nèi)核層細(xì)胞數(shù)量較少，節(jié)細(xì)胞為單層、密集排列，細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核邊緣清楚，呈圓形或橢圓形，RNFL均勻，厚度基本無明顯變化;RGC和內(nèi)核層細(xì)胞密度相當(dāng)。與正常眼壓組相比較，高眼壓組、高眼壓治療組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)可見，RGC多數(shù)崩解消失，細(xì)胞核固縮;RGC密度較正常眼壓組顯著減少，節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核細(xì)胞層厚度明顯下降，特別是高眼壓組，RGC細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞出現(xiàn)變性，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列稀疏，數(shù)量減少。但高眼壓治療組與高眼壓組比較，RGC數(shù)量殘留較多，胞核大部分存在，部分出現(xiàn)空泡樣變，內(nèi)核層和外核層結(jié)構(gòu)與正常眼壓組相似(圖1)。

2.3.2 TUNEL染色結(jié)果 正常眼壓組節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層無明顯棕色顆粒，高眼壓組和高眼壓治療組節(jié)細(xì)胞層與內(nèi)核層可見大量棕色顆粒，凋亡細(xì)胞數(shù)量高眼壓組明顯多于高眼壓治療組(P＜0.05，見表2)。高眼壓組和高眼壓治療組節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層凋亡細(xì)胞數(shù)分別與正常眼壓組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見圖2)。

Figure 2 Comparison of retinal structure among normal group，OH group and OH+phenytoin group at 4 weeks after operation(TUNEL staining，×10).A:N group;B:OH group;C:OH+P group 術(shù)后4周高眼壓組、高眼壓治療組與正常眼壓組視網(wǎng)膜形態(tài)比較(TUNEL染色，×10)。A:N組;B:OH組;C:OH+P組

2.3.3 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果 正常眼壓組無凋亡細(xì)胞(圖3);高眼壓組與高眼壓治療組均可見凋亡細(xì)胞(圖4)，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核染色體聚集、斷裂，形成粗細(xì)不均的顆粒散布于細(xì)胞漿中，有細(xì)胞漿空泡及核固縮現(xiàn)象，有典型的質(zhì)膜包裹碎裂的染色體形成的凋亡小體。

Figure 3 Normal RGC had complete cell membrane with no pyknosis and karyolysis 正常視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，各細(xì)胞器包膜完整，沒有固縮碎裂、溶解現(xiàn)象

Figure 4 RGC in OH group had concentrated cytoplasm，aggregated and ruptured chromosome with vacuole in cytoplasm 高眼壓組RGC形態(tài)，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核染色體聚集、斷裂，形成粗細(xì)不均的顆粒散布于細(xì)胞漿中，有細(xì)胞漿空泡

表2 術(shù)后4周正常眼壓組、高眼壓組與高眼壓治療組節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層細(xì)胞凋亡數(shù)量Table 2 Comparison of apoptotic cells in RGC and INL layer among normal group，OH group and OH+phenytoin group at 4 weeks after operation(，cell·μm －2)

表2 術(shù)后4周正常眼壓組、高眼壓組與高眼壓治療組節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層細(xì)胞凋亡數(shù)量Table 2 Comparison of apoptotic cells in RGC and INL layer among normal group，OH group and OH+phenytoin group at 4 weeks after operation(，cell·μm －2)

Group RGC INL N (0.40±0.15)×10 －2 (0.95±0.24)×10－2 OH (3.40±0.62)×10 －2 (18.70±2.41)×10 －2 OH+P (1.75±0.28)×10 －2 (8.75±1.03)×10－2

3 討論

3.1 慢性高眼壓動物模型的建立 卡波姆是丙烯酸與烯丙基蔗糖或季戊四醇交鏈而成的高分子聚合物，是一種優(yōu)良的藥劑新輔料。此藥的最大特點(diǎn):(1)當(dāng)pH值較低時呈溶液狀，隨著pH值的升高，藥液的黏稠度逐漸增加而形成水凝膠狀，且當(dāng)pH值在6～12時最為黏稠;(2)有良好的乳化性、增稠性、助懸性和成膜性。房水的pH值主要由CO2/HCO3－的相對比例決定，正常范圍為7.5～7.6，略偏堿性。根據(jù)卡波姆特點(diǎn)及房水的特性，制成青光眼動物模型非常成功，眼壓的波動很小。本研究中眼壓造模成功后1、2周較高，3、4 周眼壓有所下降，與徐巖等［7］報(bào)道基本相符合，因此適合進(jìn)行青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)損害的研究。

3.2 TUNEL檢測 TUNEL免疫標(biāo)記法是檢測組織切片及其他標(biāo)本細(xì)胞凋亡的有效方法［11］，TUNEL法已被應(yīng)用于視神經(jīng)［12-13］和晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的檢測［14］。青光眼中RGC的選擇性損傷是以細(xì)胞凋亡為特征的，因而我們推測TUNEL免疫標(biāo)記法也同樣可用于檢測高眼壓模型中視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡。

3.3 RGC凋亡及苯妥英鈉保護(hù)機(jī)制 目前，關(guān)于青光眼神經(jīng)損害的確切機(jī)制尚不十分清楚，但對青光眼發(fā)病機(jī)制的研究表明可能有多種機(jī)制參與青光眼視神經(jīng)損傷。已知青光眼RGC凋亡的相關(guān)因素主要有神經(jīng)營養(yǎng)因子的剝奪、谷氨酸對RGC的毒性作用、自身免疫因素等［15］，以及各種損傷引起鈣離子的堆積，異常的鈣離子內(nèi)流從而導(dǎo)致神經(jīng)軸突的損傷和凋亡［16］。無論何種機(jī)制其最終的結(jié)局均是RGC的凋亡［17］，所以阻斷或延緩 RGC原發(fā)性和(或)繼發(fā)性損傷的青光眼視神經(jīng)保護(hù)治療越來越受到重視?？贵@厥藥物苯妥英鈉作為一種Na+通道阻滯劑，對各種組織的可興奮膜有穩(wěn)定作用，同時它還可以抑制神經(jīng)元的快滅活型(T)通道，抑制Ca2+內(nèi)流［18］。因而對Ca2+的動態(tài)平衡和神經(jīng)遞質(zhì)的正常傳遞具有顯著作用［19］。

我們研究單位面積內(nèi)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層細(xì)胞凋亡數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在正常眼壓下，苯妥英鈉對視網(wǎng)膜細(xì)胞無明顯作用。高眼壓治療組與高眼壓組均有大量節(jié)細(xì)胞以及內(nèi)核層細(xì)胞凋亡，通過HE染色可見節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層均有各種組織學(xué)改變，并且TUNEL染色顯示高眼壓組細(xì)胞與高眼壓治療組有明顯差異(P ＜0.05)，這與駱榮江等［20］的研究結(jié)果基本一致，說明苯妥英鈉可減少高眼壓模型中視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的凋亡數(shù)量，提示苯妥英鈉對視網(wǎng)膜各層細(xì)胞均有保護(hù)作用。高眼壓組與正常眼壓組光鏡下節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層凋亡細(xì)胞數(shù)量均有明顯差異(均為P＜0.05)。電鏡下高眼壓組、高眼壓治療組均有凋亡小體，而正常眼壓組均看不到凋亡小體，凋亡細(xì)胞數(shù)量高眼壓組明顯高于高眼壓治療組，凋亡同時視網(wǎng)膜各層厚度變薄，節(jié)細(xì)胞層與內(nèi)核層最為明顯，細(xì)胞間隙變大，高眼壓仍然是青光眼視神經(jīng)損傷的最重要因素。

綜上所述，苯妥英鈉作為臨床上一種廣泛應(yīng)用的抗驚厥藥物，其安全使用范圍及副作用已被大家所掌握，未來作為治療青光眼視神經(jīng)細(xì)胞凋亡的藥物有很好的前景。

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