失重對(duì)大鼠髁突軟骨細(xì)胞中TNF－αmRNA表達(dá)的影響*

金波濤，于紹冰，鄭衛(wèi)衛(wèi)，于 潔，曹 巖

失重環(huán)境能引起機(jī)體血液動(dòng)力學(xué)的改變，從而使心血管系統(tǒng)和咀嚼肌、骨骼肌發(fā)生一系列適應(yīng)性變化。近年來，有關(guān)失重狀態(tài)下，咀嚼肌的變化逐漸得到學(xué)者的關(guān)注，由此是否可以引起對(duì)顳頜關(guān)節(jié)病(temporomandibular disorders，TMD)國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。為了進(jìn)一步探討失重環(huán)境與TMD的關(guān)系，本研究擬采用尾部懸吊模擬失重大鼠模型，應(yīng)用組織形態(tài)學(xué)方法，觀察失重不同時(shí)期對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular joint，TMJ)內(nèi)相關(guān)炎性因子TNF－α的表達(dá)，以探討其在顳下頜關(guān)節(jié)病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和方法 SD大鼠，一級(jí)，60只，體重(150±10)g，雄性，由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供。大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，分別為懸吊1、3、5周及對(duì)照組，每組15只。懸吊組進(jìn)行尾部懸吊［1］;對(duì)照組不做任何處理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照有關(guān)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)及使用規(guī)則實(shí)施。各組大鼠在同一條件下以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料單籠喂養(yǎng)，大鼠飼養(yǎng)籠具、飲水瓶定期消毒，使用墊料均經(jīng)高壓滅菌。稱量大鼠體重1次/5 d，自由進(jìn)水飲食，室溫維持在(21±2)℃，相對(duì)濕度45% ～55%，動(dòng)物飼養(yǎng)房實(shí)行12 h光照與12 h黑暗交替循環(huán)。

1．2 軟骨細(xì)胞的分離 直視下切取髁突軟骨層，放入盛有無鈣平衡鹽液(D－Hanks液)的平皿中，眼科剪盡量剪碎，移入離心管內(nèi)10倍量胰蛋白酶37℃振蕩，消化30 min，0．2%膠原酶II 37℃振蕩下消化2 h，10 ml混合培養(yǎng)基(含20%胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，抗壞血酸50 U/ml)培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后首次換液，以后隔天換液。透明軟骨細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，進(jìn)行傳代，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，0．5%胰蛋白酶約10 ml消化5 min，DMEM混合培養(yǎng)基反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，消化傳代至平底24孔培養(yǎng)板，每孔種植細(xì)胞數(shù)約5×10G個(gè)。

1．3 TNF－α含量測(cè)定 用ELISA法定量測(cè)定大鼠髁突軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物上清TNF－α含量，嚴(yán)格按Promage公司試劑盒使用說明書操作。

1．4 總RNA提取 PBS0．01%mol/L，沖洗離心后加Catrimox－14AM等量簡(jiǎn)單地粉碎細(xì)胞，GeneQuaant－pro-RNA/DNA定量RNA最后溶于RNA緩沖液中，吸取5 μl RNA樣品在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件:水浴5 min，37℃水浴5 min，37℃水浴60 min及 70 min 加熱 10 min，PCR 反應(yīng)體系為 50 μl，擴(kuò)增條件為:變性94℃ 30 s，復(fù)性50℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，循環(huán)35次，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察攝片。

1．5 髁突軟骨細(xì)胞分離純化 按常規(guī)方法以髁突軟骨細(xì)胞分離液分離靜脈血髁突軟骨細(xì)胞PBMC采用異硫氰酸胍一步法，嚴(yán)格按Promage公司試劑盒使用說明書操作。cDNA合成:0．5%焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理過的微量離心管中，依次進(jìn)行。RT－PCR參數(shù):TNF－α循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性3 min;變性94℃1 min，退火58℃115 min，延伸72℃2 min，循環(huán)30次;最后延伸2 min。引物設(shè)計(jì)如下:

TNF－α上游(5’－3’):AGG CGC TCC CCA AAA AGA TG;下游(5’－3’):TGG CGG AGA GGA GGC TGA CT。

β－actin上游(5’－3’):CTA TCG GCA ATG AGC GGT TC;下游(5’－3’):CTT AGG AGT TGG GGG TGG CT。

2 結(jié)果

TNF－αmRNA在懸吊1周表達(dá)最強(qiáng)，以后逐漸達(dá)到正常水平;懸吊1周組細(xì)胞因子mRNA升高最顯著，較懸吊3、5周2組有所下降并接近對(duì)照組。對(duì)照組變化不大，但與各懸吊組相比較明顯降低。見表1。

表1 各時(shí)點(diǎn)兩組TNF－αmRNA水平(n=15，±s)

表1 各時(shí)點(diǎn)兩組TNF－αmRNA水平(n=15，±s)

注:與對(duì)照組比較*P＜0．05

懸吊時(shí)間 對(duì)照組 懸吊組1 周 0．453 ±0．028 0．981 ±0．024*0．439 ±0．023 0．510 ±0．016 3 周 0．454 ±0．021 0．646 ±0．017 5周

3 討論

微重力或模擬失重環(huán)境會(huì)導(dǎo)致肌肉的結(jié)構(gòu)、功能及電生理學(xué)特性發(fā)生一系列的變化，如肌肉趨于縮性改變［2］、收縮功能下降［1］、超微結(jié)構(gòu)及生化特性的改變等［3］，但這些變化的分子機(jī)制尚不清楚。那么，與咬肌密切相關(guān)顳下頜關(guān)節(jié)是否會(huì)因?yàn)橐Ъ」δ艿淖兓兓?從本文結(jié)果可以看出，這種模擬失重環(huán)境能夠引起顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)炎性因子發(fā)生變化。

目前，TMD的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不明了，有研究發(fā)現(xiàn)顳下頜關(guān)節(jié)紊亂癥患者的關(guān)節(jié)局部組織產(chǎn)生大量細(xì)胞因子TNF－α等，然而這些細(xì)胞因子對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、代謝和凋亡的作用機(jī)制和影響途徑迄今尚無定論［4］。TNF－α由單核吞噬細(xì)胞和其它類型細(xì)胞產(chǎn)生并作用于這些細(xì)胞來調(diào)節(jié)黏附分子、免疫球蛋Fc受體、一氧化氮合成和金屬蛋白酶產(chǎn)生及其它細(xì)胞因子分泌，同時(shí)促進(jìn)結(jié)締組織和內(nèi)皮細(xì)胞激活。其主要功能是致炎作用，并能直接或間接地介導(dǎo)骨組織吸收。已經(jīng)有證據(jù)表明TNF－α在軟骨細(xì)胞的降解－退變過程中起到最重要的分解作用。本文結(jié)果說明懸吊1、3、5周時(shí)，TMJ髁突軟骨有嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，而隨著時(shí)間增加，炎性反應(yīng)會(huì)漸漸減輕，這可能因?yàn)楣P者的研究采取了單一的失重模式，大鼠漸漸適應(yīng)了這種方式的原因。

細(xì)胞因子是低分子量蛋白質(zhì)，是炎癥和免疫過程起始因子和效應(yīng)器，其中TNF－β起重要作用。T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后表達(dá)IL－1受體，在IL－1作用下被活化，從而分泌 IL－2、IFN、GM －CSF、IL－4等細(xì)胞因子，增加T細(xì)胞表面MHC2類抗原的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF，并通過單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL－8介導(dǎo)對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用，加速血纖維蛋白原、C反應(yīng)蛋白等的合成［5］。TNF－活化單核/巨噬細(xì)胞，提高其殺傷活性，釋放超氧、促進(jìn)NO、IL－2等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上，從而參與炎癥反應(yīng)［6］。

［1］ZB，Zhang LF，Jin JP．A proteolytic NHZ －terminal truncation of cardiac troponin I that is up － regulated in simulated microgravity［J］．J Biol Chem，2001，276(19):15753 －15760．

［2］List T，Wahlund K，Larsson B．Psychosocial functioning and dental factors in adolescents with temporomandibular disorders:a casecontrol study［J］．J Orofac Pain，2001，15(3):218 －227．

［3］Zhang L，Wang YY，Yu ZB．Depressed responsiveness of cardiomyocytes to isoproterenol in simulated weightlessness rats［J］．Acta Physiol Sin，2007，59(6):845 －850．

［4］ Convertino VA．Status of cardiovascular issues related to space flight:Implications for future research directions［J］．Respir Physio1 Neurobiol，2009，169(Suppl 1):s34 － s37．

［5］Dalekos GN，Elisaf M，Bairaktarl E，et al．Increased serum levels of interleuk in－1 in the systemic circulation of patients with essential hyperten sive patients［J］．J Lab Clin Med，1997，129(3):300－305．

［6］Futrakul N，Buthep P，Patumarys，et al．Enhanced tumor necrosis factor in the serum and renal hyperfusion in nephrosis associated with focal segment glomerlo-sclerosis［J］．Ren Fail，2002，22(2):213－215．