5－HT2B受體阻斷劑對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)的肥厚心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡的影響

白崇峰，于晉建，魏云煒，王 云，黎 濤

心肌細(xì)胞凋亡是心肌肥厚病理過程中的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一，在心臟功能由代償向失代償轉(zhuǎn)化的過程中起著重要的作用［1］。研究心肌細(xì)胞的凋亡狀況，對(duì)于了解心肌肥厚的程度以及心臟功能有著重要意義。近年來研究表明，5－羥色胺（5－h(huán)ydrotriptamine，5－HT）可通過 5－HT2B受體參與誘導(dǎo)心肌肥厚［2－4］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）誘導(dǎo)心肌肥厚的病變過程中，應(yīng)用5－HT2B受體阻斷劑可顯著減輕心肌肥厚的程度［5，6］。本研究旨在觀察應(yīng)用 5－HT2B受體阻斷劑對(duì)NE誘導(dǎo)的肥厚心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及配制方法 NE購(gòu)自Sigma公司，用生理鹽水（normal saline，NS）配制成濃度為 1．5 mg／ml的溶液。SB204741購(gòu)自Tocris公司，用NS配制成濃度為2 mg／ml的溶液。兩種溶液均4℃避光保存，1周內(nèi)使用完畢。

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠Bcl－2抗體和小鼠抗鼠Bax抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，兔抗鼠Caspase－3抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，小鼠抗鼠β－actin抗體購(gòu)自Sigma公司，鼠抗兔和兔抗小鼠酶標(biāo)二抗分別購(gòu)自Santa Cruz和Sigma公司。

1．2 心肌肥厚模型建立及分組 選擇體重180～200 g雄性SD大鼠（動(dòng)物及飼料均由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）24只，隨機(jī)分成3組，每組8只，分別為對(duì)照組，肥厚組、實(shí)驗(yàn)組。肥厚組和實(shí)驗(yàn)組采用腹腔注射 NE（1．5 mg／kg，2 次／d，28 d）的方法建立心肌肥厚模型，自第15天起實(shí)驗(yàn)組給予腹腔注射 SB204741（2 mg／kg，2 次 ／d），連續(xù)注射 14 d。對(duì)照組給予腹腔注射 NS 1 ml／kg，2 次 ／d，28 d。

1．3 觀察指標(biāo)

1．3．1 心肌肥厚指數(shù) 動(dòng)物模型制備完畢后，將大鼠稱重、處死，迅速開胸摘取心臟，用4℃生理鹽水洗凈，切除心房及右心室，用濾紙吸干心臟表面水分，稱取左心室重量（LVW），計(jì)算左室重量指數(shù)（LVI），LVI＝LVW／BW（體重）。切取左室游離壁的心肌組織，橫斷后一部分迅速放入－70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫硪徊糠忠迫?0%甲醛溶液中固定備用。

1．3．2 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況 標(biāo)本固定72 h后，依次經(jīng)過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟浸透，最后經(jīng)過包埋制作成石蠟塊，用手動(dòng)切片機(jī)切片，切片的厚度控制約為5 μm，用防脫載玻片加載切片。參照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書所述步驟，將各組心肌組織切片進(jìn)行標(biāo)記染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄各組心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡的情況。高倍鏡（×400）下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，以凋亡指數(shù)（AI）反映各組心肌凋亡的情況，AI＝視野內(nèi)凋亡心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)／視野內(nèi)所有心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。

1．3．3 Western blot方法分析心肌組織中 Bcl－2、Bax以及Caspase－3的表達(dá)情況 將－70℃低溫保存的心肌組織樣品剪碎，加入組織裂解液，冰浴中用組織超聲裂解儀裂解組織，然后12 000 r／min低溫高速離心10 min，取上清液。參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書，用BCA法對(duì)各組樣品進(jìn)蛋白定量，進(jìn)而計(jì)算出電泳時(shí)所需的加樣量。將蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混勻后，放入沸水內(nèi)煮沸5 min以使蛋白變性。8%SDS－PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF上，經(jīng)封閉液封閉2～3 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗絳10 min×3次，加入酶標(biāo)二抗，室溫下孵育 1～2 h，TBST 緩沖液洗滌 10 min×3 次，TBS緩沖液洗滌10 min。在暗室中發(fā)光、壓片，然后顯影、定影、拍照。用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Quantity One軟件掃描處理目標(biāo)條帶的凈光密度值，并計(jì)算目的蛋白與β－actin灰度值的比值，分析各組心肌組織中 Bcl－2、Bax、Caspase－3 的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2．1 心肌肥厚指數(shù) 如圖1所示，與對(duì)照組相比，肥厚組大鼠則出現(xiàn)了明顯的心肌肥厚，LVI顯著增高（P＜0．01），說明該心肌肥厚模型是成功的。與肥厚組相比，實(shí)驗(yàn)組 LVI顯著下降（P＜0．05）。此結(jié)果表明，應(yīng)用5－HT2B受體阻斷劑可減輕NE誘導(dǎo)心肌肥厚的程度。

圖1 5－HT2B受體阻斷劑對(duì)LVW／BW的影響

2．2 心肌細(xì)胞凋亡情況 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況見圖2。凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕黃色，未凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核為深藍(lán)色。如圖所示，對(duì)照組的心肌組織中幾乎見不到凋亡心肌細(xì)胞，肥厚組的心肌組織中TUNEL核染色劑陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，AI明顯上升（P＜0．01），說明該組心肌組織中存在大量心肌細(xì)胞凋亡。與肥厚組相比，實(shí)驗(yàn)組心肌組織中TUNEL核染色劑陽(yáng)性的細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，AI明顯下降（P＜0．05），提示應(yīng)用5－HT2B受體阻斷劑抑制了心肌細(xì)胞的凋亡。

2．3 心肌組織中 Bax、Bcl－2 以及 Caspase－3 的表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，經(jīng)Quantity One軟件掃描處理并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，肥厚組心肌組織中Bcl－2的表達(dá)顯著降低，Bax的表達(dá)顯著升高，Bcl－2／Bax表達(dá)比例顯著降低，同時(shí)Caspase－3的表達(dá)顯著升高（P＜0．01）。而與肥厚組相比，應(yīng)用 5－HT2B受體阻斷劑SB204741的實(shí)驗(yàn)組心肌組織中Bax的表達(dá)顯著降低，Bcl－2 的表達(dá)顯著升高，Bcl－2／Bax 表達(dá)比例顯著升高，同時(shí)Caspase－3的表達(dá)顯著降低（P＜0．05）。該結(jié)果表明，在NE誘導(dǎo)心肌肥厚的病變過程中，應(yīng)用5－HT2B受體阻斷劑，可通過上調(diào)心肌組織中Bcl－2／Bax的表達(dá)比例， 降低Caspase－3的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞的凋亡。

圖2 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況（×400）

圖3 5－HT2B受體阻斷劑對(duì)肥厚心肌組織中Bcl－2／Bax及Capase－3表達(dá)的影響

3 討 論

心肌肥厚是心臟為適應(yīng)長(zhǎng)期的血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷而發(fā)生的病理改變。在早期，心肌肥厚有利于心臟功能的維持，但隨著病程的進(jìn)展，最終將導(dǎo)致心力衰竭，甚至心源性猝死［7］。雖然到目前為止，心臟功能從代償向失代償轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)換機(jī)制尚未完全闡明，但是，在其所有的可能機(jī)制中，心肌細(xì)胞的丟失很顯然是一個(gè)非常重要的因素。研究表明，心肌肥厚過程中心肌細(xì)胞的死亡主要有凋亡、自噬性死亡和壞死3種類型［8］。與壞死和自噬性死亡不同，凋亡屬于一種細(xì)胞的自殺行為，它由特殊編碼的基因控制，可被多種病理生理的變化激活，以胞漿濃縮、核固縮、染色質(zhì)聚集、DNA斷裂、細(xì)胞變圓、細(xì)胞骨架坍塌及膜性凋亡體的形成為特征［9］。心肌肥厚時(shí)，心肌細(xì)胞凋亡的比例雖然很低，但在心肌肥厚向心力衰竭的轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用［1］。

NE作為交感神經(jīng)系統(tǒng)最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在心肌肥厚的發(fā)病過程中起著重要的作用［10，11］，其過度刺激可導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，NE可通過激活腎上腺素能受體或活性氧簇誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡［12］。本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用了腹腔注射NE的方法成功誘導(dǎo)出了心肌肥厚的動(dòng)物模型，肥厚組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均出現(xiàn)了明顯的心肌肥厚。5－HT是人體內(nèi)另一種重要的生物單胺，其受體在心血管系統(tǒng)廣泛分布，并對(duì)心血管系統(tǒng)具有廣泛的生理和病理作用［13］。近年來研究表明，5－HT 可通過 5－HT2B受體參與誘導(dǎo)心肌肥厚［2－4］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在去甲腎上腺素誘導(dǎo)心肌肥厚的病變過程中，應(yīng)用5－HT2B受體阻斷劑可顯著減輕心肌肥厚的程度，降低心肌組織中5－HT的含量，并抑制5－HT2B受體表達(dá)的上調(diào)［5，6］。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者應(yīng)用 TUNEL 法檢測(cè)了各組心肌組織中心肌細(xì)胞的凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)，正常心室肌組織中幾乎看不到凋亡心肌細(xì)胞，而NE誘導(dǎo)的肥厚組心室肌組織中凋亡心肌細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，AI明顯上升，而實(shí)驗(yàn)組給予了SB204741處理后，其心肌組織中凋亡心肌細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，AI明顯下降。該結(jié)果從形態(tài)學(xué)上證實(shí)，應(yīng)用5－HT2B受體阻斷劑可抑制NE誘導(dǎo)的肥厚心肌組織中心肌細(xì)胞的凋亡。

在心肌細(xì)胞凋亡過程中，除細(xì)胞出現(xiàn)特征性形態(tài)改變外，還涉及一些凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)?？沟蛲龅鞍譈cl－2可通過多種機(jī)制如直接抗氧化、抑制前凋亡蛋白、穩(wěn)定線粒體膜等方式發(fā)揮抗凋亡作用。促凋亡基因Bax雖然與Bcl－2結(jié)構(gòu)類似，但其作用卻相反，它可與Bcl－2結(jié)合并阻止Bcl－2 的激活，發(fā)揮促凋亡作用［14］。因此，二者的比例關(guān)系決定了對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用的強(qiáng)弱。另外，Caspase－3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，也是凋亡的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者［15］。 因此，檢測(cè) Bcl－2、Bax以及Caspase－3的表達(dá)，有助于了解心肌組織中的細(xì)胞凋亡的狀況。本研究檢測(cè)了各組心肌織中 Bcl－2、Bax 以及 Caspase－3 的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，肥厚組心肌組織中Bcl－2的表達(dá)顯著降低，Bax的表達(dá)明顯增高，Bcl－2／Bax表達(dá)比例顯著降低，同時(shí)，Caspase－3的表達(dá)顯著增高，提示NE過度刺激誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的凋亡。而給予SB204741處理的實(shí)驗(yàn)組心肌組織中Bcl－2／Bax表達(dá)比率顯著升高，Caspase－3的表達(dá)顯著降低。由此可說明，在NE誘導(dǎo)心肌肥厚的病變過程中，應(yīng)用5－HT2B受體阻斷劑，可通過上調(diào)心肌組織中Bcl－2／Bax的表達(dá)比例，降低Caspase－3的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上所述，在NE誘導(dǎo)心肌肥厚的病變過程中，應(yīng)用5－HT2B受體阻斷劑不僅可減輕心肌肥厚的程度，還通過可上調(diào)Bcl－2／Bax的表達(dá)比例，降低Caspase－3的活性發(fā)揮抗凋亡作用，亦即5－HT可能通過激活5－HT2B受體參與NE誘導(dǎo)的心肌肥厚和心肌細(xì)胞凋亡，其具體的細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

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