不同方法診斷低水平HCV的比較

楊小嬌 郁金紅

除酶法(EIA)外，抗-HCV的檢測一般采用化學發(fā)光微粒子免疫分析(CMIA)和電化學發(fā)光免疫分析(ECLIA)。但孕婦和腎病或類風濕疾病患者采用這些篩查方法易受到假陽性或假陰性結果的限制，需要進行補充或驗證性測試，特別是對于較低HCV流行率的人群?；瘜W發(fā)光免疫分析(CLIA)方法檢測HCV-cAg能區(qū)分現(xiàn)癥和過去感染，針對感染6～8周的患者有較高靈敏度。此外，PCR和免疫印跡法(RIBA)的檢查是必要的，尤其是當HCV RNA陰性時，可以做RIBA 實驗，區(qū)分既往感染還是假陽性，有利于流行病學調查。美國CDC建議以適當?shù)男盘柦刂归撝禈颖?cut-off比率(S/CO)作為抗-HCV確認，以限制需要做補充實驗的樣本數(shù)量，化學發(fā)光法推薦為1.0～8.0，ELISA推薦為1.0～3.8[1-3]。本研究重點分析臨床檢測中不常見的低值，CMIA法檢測值在0.40～10.0，比較了不同方法的敏感度，影響因素，排除假陽性和不確定標本，重新設置較準確的截斷值，同時分析HCV-Ag和HCV RNA關系。

資料與方法

一、研究對象

2015年9月至2016年12月南京市第二醫(yī)院就診的門診HCV感染患者。CMIA檢測31例(S/CO ratio 0.40～10.0 )，33例(S/CO ratio>10.0)和20例(S/CO ratio<0.4)，所有樣本血清儲存在-20 ℃。

二、試劑

HCV抗體和抗原定量測定試劑盒由雅培貿易(上海)有限公司提供。HCV抗體定性測定試劑盒由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供，HCV RNA定量試劑盒由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供，HCV RNA>500拷貝/mL為陽性。RIBA 實驗3.0 條狀免疫印跡分析，美國全球奇隆公司提供試劑盒。其余檢查項目外送。同時檢測質控品。

三、方法

采用ELISA、CMIA、ECLIA檢測抗-HCV，熒光定量RT-PCR法檢測HCV RNA，RIBA法做HCV確認實驗，CMIA法檢測HCV-Ag。

四、統(tǒng)計方法

應用SPSS 17.0軟件繪制受試者工作特征曲線并計算抗-HCV和HCV-Ag閾值。用線性回歸計算相關性。

結 果

一、比較不同方法檢測低值HCV標本

如表1所示，用CMIA法測31份低值抗-HCV(S/CO 0.40～10.0)標本中，用RIBA測定25.81%有反應，29.03%無反應，45.16%不確定。排除不確定結果的樣本，CMIA 和ECLIA兩者比較中有52.94%檢查不一致，CMIA法假陽性率約為29.41%，假陰性率為5.88%，這31份低值標本病毒定量均是陰性。在不確定的標本中有1份RF值、IgG升高，1份IgA升高。

表1 CMIA法測抗-HCV(S/CO值在0.40～10.0)時不同方法檢測HCV結果

續(xù)表1

二、ROC曲線分析ECLIA、CMIA、HCV-Ag 和HCV RNA診斷HCV效能

如表 2, 表3和圖1，除去RIBA檢測結果為不確定標本和血不夠沒測標本，S/CO值為0.40～10.0有13份，0.00～0.30有19份，11.0～19.0有32份，總共64份樣本制作ROC曲線。ECLIA曲線下面積為1.000(95%CI：0.000～1.000)、CMIA 0.997(95%CI：0.000～1.000)、HCV-Ag曲線下面積為0.753(95%CI：0.636～0.870)和HCV RNA曲線下面積為0.679(95%CI：0.551～0.808)。

表2 CMIA法測抗-HCVS/CO 值在0.00～0.30時不同方法檢測HCV結果

表3 CMIA法測抗-HCVS/CO 值在11.0～19.0時不同方法檢測HCV結果

圖1 ECLIA(HCV Ab)、CMIA(HCV Ab)、HCV-Ag和HCV-RNA的ROC曲線

當敏感度和特異度達最大時：ECLIA、CMIA、HCV-Ag 和HCV RNA閾值分別是 15.85 COI, 3.31 S/CO, 3.32 fmol/L和3.94E+03拷貝/mL。

三、HCV RNA和HCV Ag的相關性

64例樣本中, HCV RNA陰性的樣本沒有HCV-Ag的反應。16例HCV-Ag>3 fmol/L，HCV RNA為3.10E+04～1.80E+08 IU/mL。5例HCV-Ag陽性、HCV RNA陰性，回歸分析HCV RNA和HCV Ag的相關性R2 為0.91 (斜率=0.6855, 截距=1.6199)差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)。

四、RIBA結果

RIBA方法檢測84份樣本，28份(33.3%)為陰性，40份(47.6%)為陽性，16份(19%)為不確定。40份RIBA陽性的結果中，97.5%顯示 core 和NS3抗原陽性，37.5%顯示NS4-1和NS5抗原陽性，只有2.5%顯示 NS4-2陽性。16份不確定標本中分別與Core (43.8%) 和NS3 (56.2%)反應。NS4 和NS5均沒有反應。

討 論

2013年美國不再推薦RIBA方法。但是類似的確認實驗INNO-LIA方法在歐洲應用，對于沒有開展HCV RNA檢測的單位，可以參考RIBA的結果[4]。流行病學調查需要對于抗HCV陽性、HCV RNA陰性的患者，通過RIBA實驗區(qū)分是既往感染還是假陽性，其中低值抗-HCV樣本最難區(qū)分。有報道477份抗體陽性的標本，RIBA實驗68%真陽性，22%假陽性，10%不確定[5]。這些假陽性結果可能與RF有關，RF可能與免疫球蛋白、腎病綜合征、肝病和其他病毒或寄生蟲感染存在交叉反應。本研究中，抗HCV低值時，有約四分之一是既往感染，有一半是不確定的。除去不確定的樣本，有約近三分之一是假陽性，不確定樣本中有2個樣品可能受到RF或IgG或IgA的影響。CMIA 和ECLIA兩者比較中有52.94%不一致。雖然生物素酶聯(lián)免疫吸附法第三代比第四代具有更高的特異性，CMIA與ELISA結果也有33.3%不一致。ELISA法抗HCV假陽性率為39.42%， S/CO> 3.8時陽性率為98.5%，1 < S/CO < 3.8時陽性率僅為30%，有報道為26%[6]。

在39個陽性樣品測試通過RIBA，HCV-Ag值較低的樣本，用ECLIA法時有較高的抗-HCV值。其中一個原因可能與ECLIA的檢測范圍更廣有關，另一個原因可能是患者在HCV感染急性期，HCV-Ag較高，抗-HCV較低；當處于恢復期或慢性期時，抗-HCV呈下降趨勢，而HCV Ab呈穩(wěn)定上升趨勢。雅培HCVAg和羅氏HCV RNA兩種方法具有較高的相關性，這一結果與其他報告相似[7, 8]。CMIA法較ELISA法更靈敏，HCV基因分型不影響抗原和病毒載量的正相關。

根據(jù)ROC曲線，ECLIA和CMIA的準確率較高，HCV RNA的準確率最低。主要原因是HCV RNA是病毒復制的指標，不能反映既往感染情況。HCV-Ag的cut-off值與說明書推薦的基本一致， ECLIA(15.85 COI)、CMIA(3.31 S/CO)和HCV RNA(3.94E+03拷貝/mL)的值均高于本實驗室參考值，推薦這些值作為實驗室參考，可以帶來較高的診斷準確性和特異性。否則，閾值設置為S/CO比值≥1，快速篩查ECLIA或CMIA抗HCV試驗可能產生較多的假陽性結果。有報道建議ECLIA法截斷值為12.27[9]。為了確認HCV暴露，另一項研究報告稱，S/CO比值在3.0到19.9之間的樣本應進行RIBA隨訪，除非進行PCR檢測結果為陽性[10]。S/CO比值設置成10.3是提高HCV感染診斷準確性的閾值[11]。

在RIBA檢測中，硝基膜上的包裝抗原來自HCV合成抗原(Core, NS4-1, NS4-2, NS5)和大腸桿菌表達重組蛋白抗原NS3。對于RIBA不確定的樣本，抗-Core反應活性主要與在感染恢復后抗HCV濃度逐漸下降有關，其目的是檢測特定的細胞免疫記憶對HCV的反應，作為之前與病毒接觸的反應。另一個可能的原因是Core和NS3表現(xiàn)出優(yōu)先的抗原表達，而NS4和NS5表現(xiàn)較低是非優(yōu)勢抗原?；瘜W發(fā)光微粒子免疫測定通過檢測HCV基因組中候選結構蛋白抗體C(核心區(qū)第1至150個氨基酸)和非結構蛋白抗體(NS3、NS4)。該方法覆蓋了整個HCV基因組，對于定性檢測HCV是有效的，敏感性有顯著提高。Cobas是通過利用核心NS3和NS4蛋白肽的表達及重組抗原檢測抗HCV，而ELISA板上覆蓋重組HCV基因的結構和非結構段?？梢?，雖然選擇的大多數(shù)試劑都含有NS3區(qū)和核心區(qū)，但在包被或合成抗原的過程、抗原純度和載體的選擇仍有許多差異。

綜上所述，通過對幾種HCV診斷方法的綜合分析，低水平的抗HCV更需謹慎分析。假陽性、假陰性結果會給臨床和患者錯誤的提示，耽誤治療。因此不能盲目相信儀器的結果，對有疑問的應結合病史和臨床其他檢查來判斷，必要時重新復查，然后做確認實驗或核酸檢測。