高效液相色譜法測定谷氨酰胺的含量

秦朝英++馮瑞彩++姜媛嬡++崔節(jié)榮++陳平++閆倩瑩++田智慧

摘 要：建立高效液相色譜法測定谷氨酰胺含量的方法。色譜柱為氨基柱，流動相為：0.05 mol/L的磷酸二氫鉀（取磷酸二氫鉀6.8 g，加水至1000 ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）∶乙腈=70∶30，檢測波長為215 nm，結(jié)果表明該方法在所試驗的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r為0.999，精密度RSD等于0.37%，平均回收率為98.3%。

關(guān)鍵詞：谷氨酰胺 高效液相色譜法 測定

中圖分類號：R927 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2014）05（b）-0240-02

谷氨酰胺（Glutamin）亦被稱作麩酰胺酸，為人體中含量最豐富的非必需氨基酸。臨床上主要用于改善胃潰瘍和十二指腸潰瘍的癥狀。常見的分析方法有毛細管電泳法[1]。本文建立了通過高效液相色譜法測定谷氨酰胺的方法，實驗證明該方法操作簡便、專一性及靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器

HLPC色譜儀型號：LC-20A，色譜儀編號：L20134506488AE，分析天平型號：AE100 分析天平編號：LS012，超聲波型號：AS3120A，檢測波長：λ=215 nm。

1.2 色譜條件

檢測器型號：SPD-20A，檢測器靈敏度：2.0AUFS柱溫：35 ℃，進樣體積：20 ul流速：1.0 ml/min，流動相：0.05 moL/L的磷酸二氫鉀（取磷酸二氫鉀6.8 g，加水至1000 ml，用磷酸調(diào)節(jié)PH值為4.0）∶乙腈=70∶30，色譜柱：NH￠4.6×250 mm，色譜柱號：312316。

1.3 材料與試劑

乙腈（色譜純，康科德公司），磷酸二氫鉀（AR級），磷酸（AR級），谷氨酰胺對照品（山東寶齡生物技術(shù)有限公司），高純水。

1.4 樣品制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱取谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品250 mg于50 ml容量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，搖勻，再精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用流動相稀釋定容至刻度，搖勻，備用。其濃度為1 mg/ml。

樣品溶液的制備：稱取本品約250 mg，精密稱定于50 ml容量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，搖勻，再精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用流動相稀釋定容至刻度，搖勻，備用。其濃度為1 mg/ml。

1.5 測定方法

分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液盛裝于2 ml自動進樣瓶中，進行自動進樣（進樣量為20 ul），注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計算供試品中谷氨酰胺的含量。

2 實驗結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

在上述色譜條件下，取標(biāo)準(zhǔn)溶液進行自動進樣，連續(xù)進樣6針，谷氨酰胺峰與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5；理論板數(shù)、拖尾因子，6次色譜峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）、六次色譜峰的保留時間分別為：9.80、9.79、9.79、9.78、9.70、9.71，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.2%，小于2.0%；6次色譜峰面積分別為：1205488、10665、1200380、1204391、1170905、1186594，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%小于5%；拖尾因子分別為：1.2、1.2、1.3、1.4、1.4、1.4，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.7%均小于2%；理論塔板數(shù)分別為：4886、4867、5001、5185、5545、5867，均大于4000。

2.2 線性

用對照品制備不同濃度的樣品，使其濃度分別為0.5 mg/ml、0.75 mg/ml、1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml。每個濃度連續(xù)進樣3針。以檢測得到的峰面積平均值、濃度作線性回歸，其線性回歸方程為y=1188457x，其中y為峰面積，x為谷氨酰胺濃度（見圖1），線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999。結(jié)果表明在目標(biāo)濃度0.5 mg/ml～1.5 mg/ml內(nèi)，該方法具有良好的線性關(guān)系。

2.3 準(zhǔn)確度

分別制備濃度約為1 mg/ml的對照品溶液和濃度約為1 mg/ml的樣品溶液。分別吸取樣品溶液1 ml和標(biāo)準(zhǔn)溶液0.8 ml；樣品溶液1 ml和標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ml；樣品溶液1 ml和標(biāo)準(zhǔn)溶液1.2 ml分別加入10 ml容量瓶中，用流動相稀釋定容至刻度，制備濃度分別為80%、100%、120%的三種濃度的混合溶液。每個濃度連續(xù)進樣三針，記錄實驗結(jié)果。實驗結(jié)果表明該方法在三個濃度下其回收率分別為99.5%、97.6%、97.9%。平均回收率達到98.3%，表明該測定方法具有較高的檢測準(zhǔn)確度。

2.4 精密度

稱取標(biāo)準(zhǔn)品約250 mg，精密稱定于50 ml容量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，搖勻，作為貯備液備用。再分別加標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml，用流動相稀釋定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為80%、100%、120%的三種濃度，備用。每個濃度連續(xù)進樣三針，記錄色譜圖。實驗結(jié)果表明三個實驗下其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.47%、0.42%、0.20%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.37%。該結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.5 專一性

從圖2可以看出，用該方法可以較好的分離測定谷氨酰胺的相關(guān)物質(zhì)如谷氨酸、焦谷氨酸等，具有專一性高的特點。

3 討論

本文建立的高效液相色譜法測定谷氨酰胺含量的方法，其檢測波長為215nm，流動相為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀（用磷酸調(diào)節(jié)PH值為4.0）∶乙腈=70∶30，實驗結(jié)果表明該方法在其線性范圍內(nèi)具有專一性高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確的特點。

參考文獻

[1] 吳建，鄧留杰，郭利芬，等.毛細管電泳法檢測轉(zhuǎn)化液中谷氨酰胺和谷氨酸[J].食品科學(xué)，2008，29（4）.endprint