葛春洋+馬宏佳

摘要：介紹了2014年諾貝爾化學(xué)獎獲獎成果超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和發(fā)現(xiàn)過程、獲獎?wù)吆啗r以及超分辨率熒光顯微技術(shù)的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：諾貝爾化學(xué)獎；超分辨率熒光顯微鏡；受激發(fā)射損耗顯微鏡；光激活定位顯微鏡

文章編號：1008-0546（2014）11-0002-03 中圖分類號：G633.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

doi：10.3969/j.issn.1008-0546.2014.11.001

北京時(shí)間2014年10月8日，瑞典皇家科學(xué)院宣布，將2014年諾貝爾化學(xué)獎授予美國科學(xué)家埃里克·貝齊格（Eric Betzig）、威廉姆·莫納（William Esco Moerner）和德國科學(xué)家斯特凡·赫爾（Stefan W. Hell），以表彰他們?yōu)榘l(fā)展超分辨率熒光顯微鏡所做的貢獻(xiàn)。

一、光學(xué)顯微鏡分辨率極限的存在

長期以來，光學(xué)顯微鏡的分辨率被認(rèn)為不會超過光波波長的一半，這被稱為“阿貝衍射極限”。1873年，德國科學(xué)家阿貝（E.Abbe）揭示了遠(yuǎn)場光學(xué)顯微鏡分辨率由于光的衍射效應(yīng)和有限孔徑分辨率極限而存在極限。這是由于可見光具有波動性，其可以發(fā)生衍射，因此光束不能無限聚焦。他的結(jié)論源于光學(xué)顯微鏡的分辨率的計(jì)算公式：

其中λ為光波波長，α為鏡口角的一半，n為傳播介質(zhì)的折射系數(shù)。空氣中n為1，α最大可為70度，此時(shí)，sinα約為0.94，根據(jù)波長最短的藍(lán)光計(jì)算，λ≈450nm，則分辨率最小約為200nm。即阿貝分辨率極限的數(shù)值約為200nm。

1896年，英國物理學(xué)家瑞利（Rayleigh）提出，在成像光學(xué)系統(tǒng)中，分辨率是衡量分開相鄰兩個物點(diǎn)的像的能力。由于衍射，系統(tǒng)所成的像不再是理想的幾何點(diǎn)像，而是一定大小的光斑（愛里斑），當(dāng)兩個物點(diǎn)過于靠近，其像斑重疊在一起，就可能分辨不出是兩個物點(diǎn)的像，即光學(xué)系統(tǒng)中存在著一個分辨極限，這個分辨極限通常采用瑞利提出的判據(jù)：當(dāng)一個愛里斑的中心與另一個愛里斑的第一級暗環(huán)重合時(shí)，剛好能分辨出是兩個像，他歸納出一個常用分辨率公式：

Δmin=（λ為光波波長，α為鏡口角的一半，n為傳播介質(zhì)的折射系數(shù)。）

這從另一個角度印證了“阿貝衍射極限”理論。因此，人們認(rèn)為光學(xué)顯微鏡的成像效果受到光的波長限制，最大分辨率為光波的1/2。

二、光學(xué)顯微鏡分辨率極限的突破

科學(xué)發(fā)展的進(jìn)程激發(fā)人們對更小物質(zhì)的研究渴望，因此科學(xué)家們一直致力于超分辨率顯微鏡的研究。2014年諾貝爾化學(xué)獎的三位得主以創(chuàng)新手段“繞過”（突破）了這一極限，使光學(xué)顯微鏡的分辨率從微米級提高到納米級，他們的發(fā)現(xiàn)使顯微鏡進(jìn)入納米顯微鏡時(shí)代。

（1）斯特凡·赫爾的貢獻(xiàn)

2014年諾貝爾化學(xué)獎得獎的原理主要為兩項(xiàng)，其一為斯特凡·赫爾研發(fā)的受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)（stimulated emission depletion，STED）。所謂的受激發(fā)射損耗（STED），指的是用一束激發(fā)光使熒光物質(zhì)發(fā)光的同時(shí)，用另外的高能量脈沖激光器發(fā)射一束環(huán)型的波長較長的激光，將第一束光斑中大部分的熒光物質(zhì)通過受激發(fā)射損耗過程淬滅至基態(tài)，并通過限制受激發(fā)射抑制的區(qū)域，獲得小于衍射極限的發(fā)光點(diǎn)，從而顯著地提高了顯微鏡的分辨率。2000年，赫爾使用STED顯微鏡首次得到了大腸桿菌的圖像。

（2）埃里克·貝齊格和威廉姆·莫納的貢獻(xiàn)

第二項(xiàng)原理由埃里克·貝齊格和威廉姆·莫納研究，即單分子顯微鏡的原理。該原理的核心為激活和淬滅單個熒光分子。他們通過每次分辨少數(shù)分散的分子，多次沉積這些圖像得到一個納米級的高密度的超級圖像。

在莫納之前，人們觀測熒光分子時(shí)都是同時(shí)觀測到幾百萬幾千萬個分子，得到的結(jié)果是其平均統(tǒng)計(jì)結(jié)果。而莫納是第一個能夠探測單個熒光分子的人，他于1989年觀測到單個熒光分子。能夠探測并觀察單個熒光分子對于超分辨率顯微鏡極其重要。雖然單個熒光分子成像后也是一個0.2微米的光斑，但是在沒有其他分子存在的情況下，它的中心位置可以更精確地被確定下來的。

1997年莫納發(fā)現(xiàn)變異的綠色熒光蛋白可以隨意打開和關(guān)閉，當(dāng)他用波長488nm的光線去激發(fā)某種蛋白質(zhì)時(shí)，它開始發(fā)出熒光，但一會熒光就消失了。此后不管他再使用任何光線去照射它，這個蛋白質(zhì)都無法再發(fā)出熒光。但是，當(dāng)他用波長為405nm的光線去照射它的時(shí)候，蛋白質(zhì)又再次復(fù)活并發(fā)出熒光。莫納將這些可以被激發(fā)的蛋白質(zhì)融入溶膠，使其均勻分布在其中，這使得單個分子之間的距離就能大于阿貝衍射極限。由于這些分子被分散開來，一臺常規(guī)的光學(xué)顯微鏡便可以區(qū)分來自單個分子發(fā)出的熒光——它們就像是帶著開關(guān)的小燈泡。

貝齊格發(fā)明的光激活定位顯微鏡（photoactivated localization microscopy，PALM），其中所利用的就是莫納發(fā)現(xiàn)的光激活方法。貝齊格利用微量的405nm激光照射細(xì)胞表面，使得其中極小部分熒光分子發(fā)出熒光。然后用488nm 激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子，確定這些分子的位置。再依次用405nm和488nm的激光照射，以激活另一小部分熒光分子。重復(fù)這個過程即可將樣品中的所有分子定位出來，將這些分子的圖像合成到一張圖上，最后得到了比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上分辨率的整個樣品的圖像。

值得一提的是，華裔科學(xué)家莊小威與貝齊格的工作在物理原理上完全一樣。莊小威課題組獨(dú)立發(fā)明的STORM技術(shù)使用激光“點(diǎn)亮”或“熄滅”細(xì)胞中的熒光，然后拍照。每次只“點(diǎn)亮”或“熄滅”細(xì)胞中一個位置。像逐行掃描一樣，一點(diǎn)點(diǎn)記錄細(xì)胞的圖像，最后通過多幅圖像疊合，得到完整、高分辨率圖像。莊小威發(fā)表的論文顯示，分辨率可以達(dá)到20納米。兩者的細(xì)微不同之處在于激發(fā)熒光材料的使用上，貝齊格用的是光敏蛋白，而莊小威用的是熒光染料。莊小威的相關(guān)論文于2006年8月9日發(fā)表在《自然·方法》期刊，而貝齊格的論文于次日（8月10日）發(fā)表在《科學(xué)》期刊，不過貝齊格的論文投出時(shí)間為2006年3月，比莊小威要早4個月。但貝齊格早在1995年就發(fā)表了理論設(shè)計(jì)論文。諾貝爾獎授予者解釋說這是莊小威憾失諾貝爾獎的原因。但她在超分辨率顯微鏡領(lǐng)域做出的貢獻(xiàn)仍不可否認(rèn)。

三、獲獎成果應(yīng)用前景

科學(xué)家們的成果將顯微技術(shù)帶入“納米”領(lǐng)域，讓人類能夠“實(shí)時(shí)”觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動規(guī)律，為疾病研究和藥物研發(fā)帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡，可以讓科學(xué)家們在分子水平上對活體細(xì)胞進(jìn)行研究，如觀察活細(xì)胞內(nèi)生物大分子、細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼，對于理解生命過程和疾病發(fā)生機(jī)理具有重要意義。比如：在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥（老年癡呆癥）或亨廷頓氏癥發(fā)作時(shí)，科學(xué)家們可以跟蹤與之有關(guān)的蛋白質(zhì)的變化；受精卵分裂并發(fā)育成胚胎的過程中，也可以觀察這些單個蛋白質(zhì)的變化。正如諾貝爾化學(xué)獎評審委員會所說，三位科學(xué)家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能，“理論上講，如今沒有什么物質(zhì)結(jié)構(gòu)小得無法研究?！?/p>

四、獲獎?wù)吆喗?/p>

斯特凡·赫爾

1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學(xué)家，馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所所長。1990年獲得海德堡大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1997年，在馬克斯·普朗克學(xué)會在哥廷根的生物物理化學(xué)研究所任研究員。2003年至今，赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學(xué)顯微技術(shù)部門的主任。

威廉姆·莫納

1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓?；瘜W(xué)家，單分子光譜和熒光光譜領(lǐng)域的著名專家。畢業(yè)于圣路易斯華盛頓大學(xué)。1982年，獲得康奈爾大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1998年至今，在斯坦福大學(xué)擔(dān)任教授。

埃里克·貝齊格

1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經(jīng)科學(xué)家、發(fā)明家、應(yīng)用物理學(xué)家?；羧A德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究帶頭人。他畢業(yè)于加州理工學(xué)院的物理學(xué)系，1988年獲得美國康奈爾大學(xué)博士學(xué)位。后在貝爾實(shí)驗(yàn)室工作。

參考文獻(xiàn)

[1] M？覽ns Ehrenberg .Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2014. The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[2] M？覽ns Ehrenberg，Sven Lidin. The Nobel Prize in Chemistry 2014.The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[3] 毛崢樂，王琛，程亞等. 超分辨遠(yuǎn)場生物熒光成像——突破光學(xué)衍射極限[J]. 中國激光，2008，35（9）：1283-1307

[4] 呂志堅(jiān)，陸敬澤，吳雅瓊等. 幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36（12）：1626-1634

[5] 楊鵬，艾華. 受激發(fā)射損耗顯微術(shù)及擴(kuò)展技術(shù)[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展，2011，（5）：32-40

[6] http：//www.guokr.com/article/439295/

[7] http：//tieba.baidu.com/p/3339514957/

[8] http：//money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0

H.html

三、獲獎成果應(yīng)用前景

科學(xué)家們的成果將顯微技術(shù)帶入“納米”領(lǐng)域，讓人類能夠“實(shí)時(shí)”觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動規(guī)律，為疾病研究和藥物研發(fā)帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡，可以讓科學(xué)家們在分子水平上對活體細(xì)胞進(jìn)行研究，如觀察活細(xì)胞內(nèi)生物大分子、細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼，對于理解生命過程和疾病發(fā)生機(jī)理具有重要意義。比如：在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥（老年癡呆癥）或亨廷頓氏癥發(fā)作時(shí)，科學(xué)家們可以跟蹤與之有關(guān)的蛋白質(zhì)的變化；受精卵分裂并發(fā)育成胚胎的過程中，也可以觀察這些單個蛋白質(zhì)的變化。正如諾貝爾化學(xué)獎評審委員會所說，三位科學(xué)家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能，“理論上講，如今沒有什么物質(zhì)結(jié)構(gòu)小得無法研究。”

四、獲獎?wù)吆喗?/p>

斯特凡·赫爾

1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學(xué)家，馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所所長。1990年獲得海德堡大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1997年，在馬克斯·普朗克學(xué)會在哥廷根的生物物理化學(xué)研究所任研究員。2003年至今，赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學(xué)顯微技術(shù)部門的主任。

威廉姆·莫納

1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓?；瘜W(xué)家，單分子光譜和熒光光譜領(lǐng)域的著名專家。畢業(yè)于圣路易斯華盛頓大學(xué)。1982年，獲得康奈爾大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1998年至今，在斯坦福大學(xué)擔(dān)任教授。

埃里克·貝齊格

1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經(jīng)科學(xué)家、發(fā)明家、應(yīng)用物理學(xué)家。霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究帶頭人。他畢業(yè)于加州理工學(xué)院的物理學(xué)系，1988年獲得美國康奈爾大學(xué)博士學(xué)位。后在貝爾實(shí)驗(yàn)室工作。

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[3] 毛崢樂，王琛，程亞等. 超分辨遠(yuǎn)場生物熒光成像——突破光學(xué)衍射極限[J]. 中國激光，2008，35（9）：1283-1307

[4] 呂志堅(jiān)，陸敬澤，吳雅瓊等. 幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36（12）：1626-1634

[5] 楊鵬，艾華. 受激發(fā)射損耗顯微術(shù)及擴(kuò)展技術(shù)[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展，2011，（5）：32-40

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[7] http：//tieba.baidu.com/p/3339514957/

[8] http：//money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0

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三、獲獎成果應(yīng)用前景

科學(xué)家們的成果將顯微技術(shù)帶入“納米”領(lǐng)域，讓人類能夠“實(shí)時(shí)”觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動規(guī)律，為疾病研究和藥物研發(fā)帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡，可以讓科學(xué)家們在分子水平上對活體細(xì)胞進(jìn)行研究，如觀察活細(xì)胞內(nèi)生物大分子、細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼，對于理解生命過程和疾病發(fā)生機(jī)理具有重要意義。比如：在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥（老年癡呆癥）或亨廷頓氏癥發(fā)作時(shí)，科學(xué)家們可以跟蹤與之有關(guān)的蛋白質(zhì)的變化；受精卵分裂并發(fā)育成胚胎的過程中，也可以觀察這些單個蛋白質(zhì)的變化。正如諾貝爾化學(xué)獎評審委員會所說，三位科學(xué)家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能，“理論上講，如今沒有什么物質(zhì)結(jié)構(gòu)小得無法研究?！?/p>

四、獲獎?wù)吆喗?/p>

斯特凡·赫爾

1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學(xué)家，馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所所長。1990年獲得海德堡大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1997年，在馬克斯·普朗克學(xué)會在哥廷根的生物物理化學(xué)研究所任研究員。2003年至今，赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學(xué)顯微技術(shù)部門的主任。

威廉姆·莫納

1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓?；瘜W(xué)家，單分子光譜和熒光光譜領(lǐng)域的著名專家。畢業(yè)于圣路易斯華盛頓大學(xué)。1982年，獲得康奈爾大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1998年至今，在斯坦福大學(xué)擔(dān)任教授。

埃里克·貝齊格

1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經(jīng)科學(xué)家、發(fā)明家、應(yīng)用物理學(xué)家。霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究帶頭人。他畢業(yè)于加州理工學(xué)院的物理學(xué)系，1988年獲得美國康奈爾大學(xué)博士學(xué)位。后在貝爾實(shí)驗(yàn)室工作。

參考文獻(xiàn)

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[4] 呂志堅(jiān)，陸敬澤，吳雅瓊等. 幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36（12）：1626-1634

[5] 楊鵬，艾華. 受激發(fā)射損耗顯微術(shù)及擴(kuò)展技術(shù)[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展，2011，（5）：32-40

[6] http：//www.guokr.com/article/439295/

[7] http：//tieba.baidu.com/p/3339514957/

[8] http：//money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0

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