基因魔剪：改寫生命密碼新工具

王俏琦 章元兵 張子恒 周爽 劉冀瓏

2020年10月7日，2020年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予德國(guó)馬克斯·普朗克病原學(xué)研究室的生物化學(xué)家沙彭蒂耶（E. Charpentier）和美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的生物化學(xué)家杜德納（J. A. Doudna），以表彰兩人“開(kāi)發(fā)了一種基因組編輯方法”。她們是第6位和第7位獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的女性。

沙彭蒂耶1968年出生于法國(guó)，1995年在巴黎巴斯德研究所獲得博士學(xué)位，過(guò)去20年在5個(gè)不同國(guó)家9所不同大學(xué)工作過(guò)，已獲得10項(xiàng)久負(fù)盛名的科學(xué)獎(jiǎng)項(xiàng)，目前是德國(guó)馬克斯·普朗克病原學(xué)研究所所長(zhǎng)。杜德納1964年出生于美國(guó)，1989年從哈佛醫(yī)學(xué)院畢業(yè)獲得博士學(xué)位，曾在2016年獲得世界杰出女科學(xué)家成就獎(jiǎng)，目前是加州大學(xué)伯克利分校教授、霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員。

當(dāng)細(xì)菌和病毒入侵人體，人體的免疫系統(tǒng)就會(huì)反擊。同樣，細(xì)菌在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，也形成了一套防御病毒入侵的“免疫系統(tǒng)”——CRISPR/Cas系統(tǒng)，CRISPR是成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的縮寫，Cas是CRISPR相關(guān)（CRISPRassociated）基因的縮寫。病毒侵入細(xì)菌后把自身的基因整合到細(xì)菌基因組中，利用細(xì)菌細(xì)胞復(fù)制自己的基因，而細(xì)菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識(shí)別病毒的基因，并將其從自己的基因組上切除。

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)就是由一段相當(dāng)于GPS可精準(zhǔn)定位基因組目的序列的向?qū)NA，將“上帝的手術(shù)刀”核酸內(nèi)切酶Cas9指引到特定目的序列處，由核酸內(nèi)切酶Cas9將基因組DNA切出缺口，然后利用機(jī)體自身的DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制，產(chǎn)生插入（或）刪除的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)基因敲除，或者利用外源模板序列進(jìn)行同源重組修復(fù)。

沙彭蒂耶發(fā)現(xiàn)了一種之前未知的分子——tracrRNA，而它則是細(xì)菌古老免疫系統(tǒng)CRISPR/Cas的一部分，它可通過(guò)裂解病毒DNA來(lái)對(duì)付病毒的入侵。沙彭蒂耶與杜德納合作，又成功地再造了細(xì)菌的基因剪刀，簡(jiǎn)化了剪刀的分子組成，并對(duì)基因剪刀重新編程，使其可以被控制，可以在一個(gè)預(yù)定位置切斷DNA分子。

利用CRISPR/Cas9技術(shù)可極其精確地改造動(dòng)物、植物和微生物的DNA，它對(duì)生命科學(xué)產(chǎn)生了革命性的影響。比如，構(gòu)建動(dòng)物疾病模型，為癌癥治療提供新思路，使治愈遺傳性疾病的夢(mèng)想成為現(xiàn)實(shí)，甚至提供了創(chuàng)造新物種的可能性。

CRISPR研究的歷程

一般認(rèn)為CRISPR系統(tǒng)是在1987年被首次發(fā)現(xiàn)的。日本納卡塔（A. Nakata）研究組在分析大腸桿菌基因組中與磷酸鹽代謝相關(guān)基因的過(guò)程中，偶然發(fā)現(xiàn)了位于堿性磷酸酶同工酶（iap）基因的3’端有一段長(zhǎng)度為29個(gè)堿基對(duì)的短序列會(huì)重復(fù)出現(xiàn)，當(dāng)時(shí)他們對(duì)這個(gè)特征序列本身并沒(méi)給予過(guò)多關(guān)注，甚至論文里也僅僅是提到這一序列，但并未將其命名[1]。

CRISPR系統(tǒng)被真正作為研究對(duì)象是在1993年。莫伊察（F. Mojica）在西班牙阿里坎特大學(xué)攻讀博士學(xué)位期間發(fā)現(xiàn)：地中海富鹽菌（Haloferax mediterranei），一種在西班牙圣波拉港口被發(fā)現(xiàn)的極度耐鹽的古菌，其限制性內(nèi)切酶會(huì)受到培養(yǎng)基中鹽濃度的影響，而以不同方式切割自身的基因組。在研究這種現(xiàn)象時(shí)，莫伊察發(fā)現(xiàn)了一段與微生物中已知序列都不同的長(zhǎng)約30個(gè)堿基的重復(fù)的近似回文的序列，這個(gè)固定序列之間由大約36個(gè)堿基間隔開(kāi)。之后，莫伊察又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在與地中海富鹽菌親緣關(guān)系近的沃氏富鹽菌（Haloferax volcanii），以及與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的嗜鹽古菌中，也有類似的保守序列。很快，莫伊察意識(shí)到這段序列與1987年納卡塔研究組發(fā)表的文獻(xiàn)中的細(xì)菌特征序列之間的聯(lián)系，他認(rèn)為在不同種微生物中，都存在這樣一段序列，并且它們發(fā)揮著重要的作用，最終將其命名為短規(guī)律性間隔重復(fù)序列（short regularly spaced repeats）。到2000年，莫伊察已在20種微生物中發(fā)現(xiàn)這段重復(fù)序列。之后兩年內(nèi)，研究者們迅速將對(duì)這個(gè)基因座的研究拓寬到與這段序列有關(guān)的特定基因。2002年，詹森（R. Jansen）實(shí)驗(yàn)室發(fā)表論文，首次將這段序列命名為CRISPR，將與其相關(guān)的特定基因命名為Cas基因。

但是，這段特別序列的功能在很長(zhǎng)一段時(shí)間里一直沒(méi)有弄清楚。2003年莫伊察作為CRISPR領(lǐng)域的新領(lǐng)導(dǎo)者，開(kāi)始將注意力放在將此重復(fù)序列隔開(kāi)的間隔子（spacer）上。由于間隔子序列具有種內(nèi)保守的特點(diǎn)，莫伊察將不同的間隔子序列進(jìn)行大量比對(duì)，最終發(fā)現(xiàn)有一種間隔子的序列與感染大腸桿菌的P1噬菌體基因組某段序列相吻合。此后，他又通過(guò)一系列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CRISPR中的間隔子序列來(lái)自外源噬菌體或者質(zhì)粒。值得注意的是，博洛廷（A. Bolotin）首次提出CRISPR基因座會(huì)通過(guò)反義RNA來(lái)抑制噬菌體基因的表達(dá)，雖然之后這個(gè)假說(shuō)被證實(shí)是錯(cuò)誤的，但它率先賦予了CRISPR在免疫學(xué)方面的意義。

CRISPR在細(xì)菌免疫系統(tǒng)中的作用是由霍瓦特（P. Horvath）揭示的。在克服困擾工業(yè)生產(chǎn)的噬菌體感染時(shí)，霍瓦特致力于開(kāi)發(fā)基于DNA的菌株鑒定技術(shù)，并使用CRISPR對(duì)菌株進(jìn)行基因分型。2004年，他同樣注意到間隔子與細(xì)菌對(duì)噬菌體抗性之間的聯(lián)系。2005年，霍瓦特及其同事試圖證實(shí)CRISPR是一種細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。2007年，霍瓦特描述了一種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）在被噬菌體入侵后，鏈球菌基因組內(nèi)會(huì)整合進(jìn)來(lái)自噬菌體基因組的間隔子序列，當(dāng)該鏈球菌再次被同樣的噬菌體入侵時(shí)，鏈球菌就可產(chǎn)生抗性，而如果改變這段間隔子序列，則會(huì)影響該鏈球菌的抗性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，鏈球菌獲得這種抗性需要Cas7蛋白的參與（但維持抗性不需要Cas7蛋白），而Cas9蛋白——其序列包含兩種類型核酸酶結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC）——及其產(chǎn)物，可能會(huì)切割核酸，它對(duì)抵抗噬菌體是必需的，所以，Cas9蛋白被認(rèn)為是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的活性成分。

科學(xué)家們很快開(kāi)始進(jìn)一步研究CRISPR/Cas的作用機(jī)理，第一個(gè)關(guān)鍵研究來(lái)自范德歐斯特（J. van der Oost）團(tuán)隊(duì)。他們通過(guò)將一種大腸桿菌的CRISPR系統(tǒng)插入另一種缺乏內(nèi)源性CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌菌株中，從生化角度驗(yàn)證了該系統(tǒng)是由5種Cas蛋白組成的復(fù)合物，并將其命名為級(jí)聯(lián)復(fù)合物（cascade）。然后通過(guò)依次敲除級(jí)聯(lián)復(fù)合物每個(gè)組分，證明級(jí)聯(lián)復(fù)合物對(duì)于切割從CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄而來(lái)的前體CRISPR RNA（crRNA）是必要的，最終切割產(chǎn)物是具有61個(gè)堿基的crRNA，它由上一個(gè)重復(fù)序列最后8個(gè)堿基、完整間隔子序列和下一個(gè)重復(fù)序列的起始部分組成，可將Cas蛋白引導(dǎo)至目的DNA上。隨后，范德歐斯特通過(guò)分別構(gòu)建反義方向（與mRNA和編碼鏈DNA的序列互補(bǔ)）和順義方向（僅與另一條DNA互補(bǔ)）兩種CRISPR序列，使得其可以靶向到λ噬菌體的必需基因上。他們的研究結(jié)果暗示了CRISPR不是作用于RNA，而是作用于DNA。

同年，瑪拉菲尼（L. Marraffini）和松特海默爾（E. Sontheimer）證實(shí)了CRISPR的作用靶標(biāo)是DNA。兩年后，即2010年，穆瓦諾（S. Moineau）等人發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9在目的DNA的原間隔子鄰近基序（protospacer adjacent motif， PAM）上游3個(gè)堿基對(duì)處進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂缺口（double-strand break， DSB）。

而與此同時(shí)，沙彭蒂耶正著力于研究病原體化膿性鏈球菌是如何實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控的。2011年，沙彭蒂耶等對(duì)鏈球菌內(nèi)大量小RNA進(jìn)行定位研究，發(fā)現(xiàn)其堿基序列非常接近已揭示的CRISPR基因座，一系列研究證實(shí)，一種未知的RNA分子對(duì)于CRISPR系統(tǒng)的功能實(shí)現(xiàn)具有重要作用，遂將其命名為反式激活的CRISPR RNA，簡(jiǎn)稱tracrRNA（trans-activating crRNA），tracrRNA通過(guò)與crRNA形成雙鏈體，將Cas9引導(dǎo)至靶標(biāo)。

由于之前從未接觸過(guò)CRISPR系統(tǒng)，沙彭蒂耶在一次參加在波多黎各召開(kāi)的會(huì)議上，遇到來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的杜德納博士，沙彭蒂耶邀請(qǐng)杜德納進(jìn)行合作研究，杜德納欣然接受。杜德納的同事們通過(guò)數(shù)字會(huì)議為合作制定了計(jì)劃，此前他們猜測(cè)細(xì)菌中的Cas9最終執(zhí)行切割DNA的作用，但在體外并沒(méi)有得到驗(yàn)證。

2012年，她們將重組表達(dá)的Cas9與體外轉(zhuǎn)錄的crRNA和tracrRNA聯(lián)合使用，成功構(gòu)建出可體外切割純化DNA的CRISPR/Cas系統(tǒng)：通過(guò)成熟的crRNA與tracrRNA形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)Cas9蛋白靶向結(jié)合目的DNA片段，通過(guò)切割引起DNA雙鏈斷裂，從而使得CRISPR/Cas系統(tǒng)具有編輯基因的可能[2]。

在沙彭蒂耶和杜德納的工作啟發(fā)下，美國(guó)哈佛大學(xué)丘奇（G. Church）研究組與張鋒研究組率先在哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了基因編輯[3，4]。其后，在短短幾年內(nèi)這項(xiàng)技術(shù)風(fēng)靡世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為生物學(xué)界最流行的基因編輯工具。

2013年，世界各地先后已經(jīng)有多家實(shí)驗(yàn)室使用 CRISPR/Cas9，在包括人細(xì)胞系和多種模式生物中，比如斑馬魚、酵母、線蟲、果蠅、小鼠、大鼠等，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的編輯[5]。2015年CRISPR技術(shù)被美國(guó)《科學(xué)》周刊評(píng)為年度最佳科學(xué)突破。

2016年，張鋒課題組率先將一種稱為C2c2（也稱Cas13a）的酶，用于CRISPR系統(tǒng)中，成功地對(duì)RNA進(jìn)行了編輯。同年10月份，又有科學(xué)家首次利用CRISPR/Cas9編輯過(guò)的細(xì)胞開(kāi)展人體臨床試驗(yàn)，他們從患有轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者血液中分離出的免疫細(xì)胞，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)特異性地敲除其中的PD-1基因，然后經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)，再回輸入患者體內(nèi)，以期達(dá)到治愈癌癥的目標(biāo)。

2017年，美國(guó)邁阿密大學(xué)的課題組設(shè)計(jì)了CRISPR-RNA-靶向（CRISPR-RNA-targeting， CRISPR-RT）系統(tǒng)，對(duì)RNA編輯做出了很大貢獻(xiàn)。此外，除了Cas13a，Cas13b和Cas13d的發(fā)現(xiàn)也推動(dòng)了CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用與發(fā)展。同年，劉如謙團(tuán)隊(duì)將tRNA腺嘌呤脫氨酶的蛋白定向進(jìn)化后，與CRISPR/ Cas9系統(tǒng)融合，在不引起DNA鏈斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)了A-T到G-C的轉(zhuǎn)換，且其在人體細(xì)胞中的編輯效率超過(guò)50%。為治療多種單堿基突變遺傳疾病提供了有效工具[6]。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯新工具層出不窮，2018年，劉如謙團(tuán)隊(duì)又進(jìn)化出一種能夠識(shí)別多種PAM序列的Cas9變體，提高了CRISPR/Cas9的剪輯效率。同年，杜德納發(fā)布了CRISPR/Cas14系統(tǒng)。2019年，杜德納成功地對(duì)Cas9蛋白的活性進(jìn)行了改造，使之僅在特定組織中具有活性。張鋒也開(kāi)發(fā)出CRISPR/Cas12b系統(tǒng)，極大豐富了用于基因組編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)。

2020年初，新型冠狀病毒肺炎爆發(fā)，科學(xué)家基于CRISPR/Cas13a技術(shù)開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)和定量SARSCoV-2病毒RNA的試劑盒，它無(wú)需對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，而是直接對(duì)病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)。正如沙彭蒂耶所說(shuō)：“CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)突破了界限，使基因工程技術(shù)更加地通用、有效和易操作。它的應(yīng)用似乎真的沒(méi)有什么限制[7]。”

CRISPR的工作原理

在噬菌體或質(zhì)粒等外源DNA入侵宿主后，外來(lái)核酸被加工成短片段，并被作為新的間隔子整合到宿主染色體內(nèi)的CRISPR重復(fù)間隔子序列中，這個(gè)過(guò)程相當(dāng)于宿主的一次“免疫記憶”。在外源核酸上鄰近間隔子序列下游有一段極其保守的基序（PAM），它對(duì)于間隔子序列的選擇加工非常重要。當(dāng)入侵者再次入侵時(shí)，CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被核酸內(nèi)切酶加工為成熟crRNA。crRNA的5’端包含被整合進(jìn)宿主基因組的間隔子序列，它可與外源序列互補(bǔ)配對(duì)，而3’端包含一段CRISPR的重復(fù)序列，與tracrRNA結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)。帶有Cas內(nèi)切酶的crRNA-tracrRNA組裝成核糖核蛋白復(fù)合體，通過(guò)間隔子序列與入侵核酸互補(bǔ)，進(jìn)行特異性的破壞，從而實(shí)現(xiàn)宿主（細(xì)菌）的“二次免疫應(yīng)答”[8]。

根據(jù)CRISPR基因座的不同，CRISPR系統(tǒng)可分為6種類型（Ⅰ-Ⅵ），它們有著不同的crRNA模式和特定的Cas蛋白[9]。與利用復(fù)雜的多Cas蛋白復(fù)合物進(jìn)行crRNA結(jié)合和靶序列降解的Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)不同，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)采用單一核酸內(nèi)切酶Cas9來(lái)識(shí)別雙鏈DNA的靶位點(diǎn)，核酸內(nèi)切酶Cas9的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC）分別切割兩條DNA鏈。這兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)域在PAM上游3個(gè)堿基對(duì)處剪接雙鏈DNA，HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割另一條DNA鏈。其間，tracrRNA與crRNA中的重復(fù)序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成獨(dú)特的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)。這個(gè)雙鏈RNA分子中約20個(gè)堿基靶向與其序列互補(bǔ)的DNA序列，并由Cas9進(jìn)行DNA位點(diǎn)特異性切割，產(chǎn)生平末端的雙鏈斷裂缺口。然后，通過(guò)機(jī)體自身的DNA修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。一種是極易出錯(cuò)的非同源末端連接修復(fù)（nonhomologous end joining， NHEJ），在切割位點(diǎn)產(chǎn)生短的隨機(jī)插入和（或）缺失；一種是通過(guò)高保真的同源重組修復(fù)（homology directed repair， HDR），在同源修復(fù)模板指導(dǎo)下，對(duì)DSB位點(diǎn)進(jìn)行精確的修復(fù)。后來(lái)，通過(guò)人為地將crRNA和tracrRNA進(jìn)行組合，形成單條RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)，得到嵌合的單鏈向?qū)NA（singleguide RNA， sgRNA），就極大地簡(jiǎn)化了CRISPR基因編輯方法。

CRISPR的優(yōu)勢(shì)

基因編輯技術(shù)從本質(zhì)上來(lái)講，是對(duì)DNA雙鏈斷裂損傷和修復(fù)機(jī)制的應(yīng)用。外在因素如輻射和內(nèi)在因素如細(xì)胞代謝產(chǎn)物，都會(huì)使DNA產(chǎn)生不同程度的損傷，DNA雙鏈斷裂是真核細(xì)胞中常見(jiàn)的一種DNA損傷類型，DNA雙鏈斷裂后，機(jī)體會(huì)通過(guò)兩種修復(fù)機(jī)制進(jìn)行及時(shí)修復(fù)：非同源末端修復(fù)和同源重組修復(fù)[10]。截至目前，基因編輯技術(shù)已經(jīng)過(guò)三代更迭，從鋅指核酸酶（zinc finger nucleases， ZFNs）技術(shù)，轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶（transcription activator like effector nucleases， TALENs）技術(shù)，再到CRISPR/Cas技術(shù)[11]。

ZFNs是融合蛋白，由鋅指蛋白和細(xì)菌的FokⅠ限制酶組成。鋅指蛋白包括串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域，它們屬于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別3個(gè)堿基，串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域使得ZFNs可潛在地結(jié)合到長(zhǎng)的核苷酸序列上。使用時(shí)需成對(duì)設(shè)計(jì)，一個(gè)切割位點(diǎn)在側(cè)翼的正義鏈，另一個(gè)切割位點(diǎn)在側(cè)翼的反義鏈。當(dāng)切割位點(diǎn)兩側(cè)的ZFNs結(jié)合后，F(xiàn)okⅠ限制酶在該位點(diǎn)發(fā)生二聚化并進(jìn)行切割，造成具5’突出端的雙鏈斷裂。ZFNs技術(shù)使得DSB不必依賴自然發(fā)生，從而為基因工程發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

TALENs的構(gòu)造與ZFNs類似，由串聯(lián)的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子（TALE）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和FokI限制酶組成。與ZFNs不同的是，每個(gè)TALE蛋白識(shí)別單個(gè)特異性核苷酸，因此其結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，但設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)單。然而，ZFNs和TALENs技術(shù)操作難度大、構(gòu)建組裝時(shí)間長(zhǎng)，容易在細(xì)胞中積累，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明它們會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由向?qū)NA和Cas核酸酶組成，向?qū)NA結(jié)合到目的基因上，引導(dǎo)Cas蛋白切割目的序列產(chǎn)生雙鏈斷裂，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同Cas蛋白。通過(guò)修飾向?qū)NA的序列，就可以切割所選的任何靶序列。類似于ZFNs和TALENs系統(tǒng)，CRISPR/ Cas系統(tǒng)可用于通過(guò)非同源末端連接修復(fù)方式，在DNA切割位點(diǎn)處引入隨機(jī)突變，也可通過(guò)共同注射與DNA同源的工程化DNA載體，通過(guò)同源重組修復(fù)方式引入特定突變或插入。CRISPR/Cas系統(tǒng)使基因定點(diǎn)修飾變得更加高效。

與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)有很多優(yōu)勢(shì)：①設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單。CRISPR-Cas系統(tǒng)不像ZFNs和TALENs是依賴于蛋白與靶DNA之間的識(shí)別，而是由向?qū)NA和靶DNA之間形成核糖核苷酸復(fù)合物，利用核糖核苷酸識(shí)別靶向基因。②效率高，成本低。如創(chuàng)建突變小鼠時(shí)，僅需要將編碼Cas蛋白和向?qū)NA的RNA直接注射到小鼠胚胎中，相較轉(zhuǎn)染和選擇小鼠胚胎干細(xì)胞注射小鼠、再進(jìn)行同源重組的方法，可節(jié)省幾個(gè)月甚至幾年時(shí)間。③可同時(shí)進(jìn)行多基因突變操作。Cas9蛋白單體可與任意數(shù)量不同序列的特異性向?qū)NA組合，輕松實(shí)現(xiàn)用CRISPR/Cas9文庫(kù)進(jìn)行多重基因組編輯。

CRISPR的應(yīng)用與展望

在短短不到10年時(shí)間里，CRISPR得到了前所未有的高速發(fā)展，基于CRISPR的各類技術(shù)已在科研、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等諸多方面得到廣泛應(yīng)用。研究人員可以精確編輯引發(fā)疾病的突變基因，以使從根源上治愈此前束手無(wú)策的疾病。比如，通過(guò)特殊的病毒將CRISPR系統(tǒng)遞送到特定細(xì)胞中，針對(duì)性地修復(fù)致病的突變基因，目前這已在鐮刀型貧血癥、杜氏肌萎縮癥等疾病中成功驗(yàn)證，并尋求臨床實(shí)驗(yàn)[12]。在農(nóng)業(yè)基因育種上，CRISPR技術(shù)可以對(duì)農(nóng)作物基因組進(jìn)行更便捷而又精確的修飾，以獲得更好的遺傳性狀，比如增強(qiáng)農(nóng)作物抗性、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、提高產(chǎn)量。

CRISPR盡管其在基因編輯上展示出了巨大的潛力，但也存在不可忽視的風(fēng)險(xiǎn)。自CRISPR技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，關(guān)于其造成脫靶（即可能切割非目的序列的風(fēng)險(xiǎn)）的討論就從未停止過(guò)，盡管也在不斷地進(jìn)行優(yōu)化，降低脫靶率，但至今尚未從根本上解決問(wèn)題，錯(cuò)誤地修飾其他基因可能會(huì)造成一系列無(wú)法想象的嚴(yán)重后果，這是CRISPR應(yīng)用所面臨的一大障礙。

基因編輯導(dǎo)致的倫理問(wèn)題，除了在醫(yī)療方面有待進(jìn)一步討論和解決外，還有對(duì)于基因改造的倫理問(wèn)題，比如用于強(qiáng)化人的某些生理機(jī)能，甚至造出一個(gè)“定制人”，都是需要我們認(rèn)真思考和對(duì)待的?，F(xiàn)今在人類胚胎上的應(yīng)用應(yīng)當(dāng)受到嚴(yán)格管控，在關(guān)注其帶來(lái)的增益效果時(shí)，其帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)一樣應(yīng)是每個(gè)人必須深思熟慮。

管控風(fēng)險(xiǎn)、避免違反倫理道德，并將其合理應(yīng)用到生活中，是人類共同的責(zé)任。我們要在風(fēng)險(xiǎn)和倫理問(wèn)題上時(shí)刻保持警惕和謹(jǐn)慎，也期待CRISPR在將來(lái)為人類帶來(lái)更多的意想不到的驚喜。

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關(guān)鍵詞：諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 基因編輯 CRISPR 修復(fù) ■