古DNA研究概覽

劉雅琳

DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳信息載體，能從分子層面反映生物個體之間的差異。通過深度挖掘古代材料中的DNA信息，可以了解生物群體的歷史演變情況，也能探究生物類群之間的系統(tǒng)進化關系。但由于古DNA難以長久保存，內(nèi)源DNA含量低（獲得的DNA絕大部分是外源的微生物DNA），且容易受到污染（主要指出土后現(xiàn)在生活人的接觸造成的污染），所以從化石中獲取屬于研究對象的內(nèi)源古DNA并進行深入分析研究非常困難。但也存在極個別由于保存環(huán)境理想，樣本可能保留了微量內(nèi)源DNA的情況，這些材料給研究古DNA提供了機會。隨著技術手段的不斷提高，科學家已能從這些保存良好的材料中獲取極微量的古DNA片段。再利用生物信息學技術，將高度破碎化的DNA片段信息進行拼接，從而獲得古代樣本中的遺傳信息，使我們能夠回溯到樣本生存的年代，以更廣闊的視角來分析人、動植物，甚至于微生物的遺傳歷史。

古DNA研究簡史

分子克隆技術、聚合酶鏈反應（PCR）技術相繼誕生之后，很快被引入古DNA研究中，許多學者試圖從博物館樣本、洞穴沉積物和永久凍土保存的古代動植物，以及古人類材料中獲取DNA。1984年，希古奇（R. Higuchi）等獲取了已滅絕動物斑驢的線粒體DNA序列片段，這是國際公認的古DNA研究開端[1]。然而，由于當時的技術和對古DNA特征認識的不足，早期研究中獲得的古DNA大多是來自外界的污染，且大部分結果不可重復。探索過程中，科學家逐漸積累了經(jīng)驗，不斷改進實驗技術，為后來的研究發(fā)展奠定了基礎。

隨著研究的深入，科學家們開始意識到，對于高度降解的古DNA來說，規(guī)范的實驗標準十分重要，否則實驗結果將由于污染而不可重復。隨著古DNA提取方法的改進，以及研究標準的建立和完善，古DNA研究正式進入可重復的階段。這一階段研究的對象側(cè)重于含量相對豐富的線粒體DNA片段或者少量核基因序列。越來越多的實驗室開始進行相關方面的嘗試，推動了這一新興研究方向的快速發(fā)展。然而，由于PCR技術很難正確擴增含量極低的內(nèi)源DNA片段，導致部分古DNA實驗結果仍然不可重復，所以針對人類的古DNA研究方法在該階段依舊受到極大的質(zhì)疑[2]。

隨著二代測序技術的誕生，古DNA研究迎來了高速發(fā)展的時代。由于二代測序技術能夠得到極短的DNA片段信息（這與古DNA的特征相似），所以實驗人員可以進行測序，并通過生物信息技術進行拼接，來獲得可靠的古DNA數(shù)據(jù)。實驗方法也在這一階段不斷被革新，2010年拉斯馬森（M. Rasmussen）等報道了4000多年前的愛斯基摩人基因組[2]，格林（R. E.Green）等依據(jù)3個尼安德特人樣品繪制了尼安德特人的基因組草圖[2]。隨后，越來越多的古人類基因組被公布出來，如丹尼索瓦人、早期現(xiàn)代人（包括田園洞人、Ust’-Ishim和Oase 1）等[3]，研究也逐漸深入化和多元化。這些研究共同推動了古人類DNA研究不斷前進，為古人類遷徙路線及人群間基因交流的探索提供了遺傳學支持。

古DNA研究難點

獲取合適的材料是開展古DNA研究的第一個難點。古代材料由于距今年代久遠，絕大部分已經(jīng)完全降解，保存良好的樣品十分稀少。例如，在中國南方溫暖潮濕的氣候條件下，很難發(fā)現(xiàn)保存良好的樣本。

其次，古樣本中內(nèi)源DNA含量極低，獲取它們十分困難。內(nèi)源DNA與環(huán)境中的微生物DNA混雜在一起，由于提取出的總DNA中，大部分是外源雜質(zhì)DNA，內(nèi)源DNA的比例非常低。即便是質(zhì)量相對較好的樣品，也難以提取出足量的DNA，所以，有時候需要反復實驗才能得到足夠用于分析的DNA信息。研究人員需要在混雜的DNA中，將含量極少的內(nèi)源DNA分離出來，并進行研究。例如，第一個尼安德特人基因組草圖是通過1%—5%的內(nèi)源DNA重建的[4]。因此，科學家一直關注如何更好地將外源與內(nèi)源DNA分離開來，如何降低外源雜質(zhì)的影響等問題。

再次，古DNA還容易在獲取時遭受到出土后現(xiàn)在生活人的接觸造成的污染。任何形式的接觸都可能將操作人員的DNA帶入樣品中，進而對內(nèi)源DNA造成污染。因此，古DNA的提取要在古DNA超凈實驗室中進行，實驗人員需全身防護。但即便是在超凈室內(nèi)、防護設備齊全與操作規(guī)范的前提下，也不能完全避免實驗中的污染，所以這就要求研究人員在每一步都要建立空白對照，最終獲得數(shù)據(jù)進行相關的污染評估。

另外，DNA損傷也是古DNA研究面臨的關鍵問題之一。DNA損傷是一種正常的生命現(xiàn)象，時刻在生物體內(nèi)發(fā)生，生物對其也有一套完善的修復機制，但是這種機制隨著生物的死亡而停止工作。DNA損傷程度與時間、溫度、酸堿度、濕度等因素有關，在寒冷干燥環(huán)境中保存的DNA損傷程度會小一些。生物死后的DNA損傷會導致DNA高度碎片化，且會帶來編碼錯誤，直接影響DNA測序的質(zhì)量。

為了克服以上困難，研究人員提出了許多在實驗環(huán)節(jié)中的優(yōu)化方案，比如在發(fā)掘和實驗過程中嚴格遵守操作流程，使用特殊的酶對古DNA片段進行損傷修復等。新的古DNA捕獲技術是其中一項關鍵技術，該技術大致分以下幾步：誘餌設計（能夠特異性識別古DNA的探針與磁珠相連形成誘餌）、總DNA獲取、文庫制備、雜交捕獲、雜質(zhì)DNA片段清除、高通量測序[5]。我們利用這一技術，將4萬年前田園洞人的內(nèi)源DNA含量，從捕獲前的不足0.03%提高到捕獲后的46.8%[6]。同時，新古DNA捕獲技術也可用于對內(nèi)源DNA含量極低的樣本開展研究。除此以外，古DNA單鏈文庫的構建同樣是關鍵技術之一。采用新型的古DNA單鏈文庫技術，能夠獲取古樣品中單鏈DNA片段的信息，極大地提高古DNA片段的來源。針對古DNA特點開發(fā)的提取、文庫構建、古DNA捕獲和測序等技術，推動了古DNA研究的高速發(fā)展。

古DNA技術的重要意義

古DNA技術在諸多方面發(fā)揮了重要作用，已經(jīng)幫助我們回答了以下問題：繪制了已滅絕的古老型人類（尼安德特人、丹尼索瓦人）基因草圖，并說明古老型人類與非洲以外現(xiàn)代人之間存在基因上的相互影響[3]；現(xiàn)代人祖先走出非洲并非只有一條遷徙路線[7]；中國南北方古人群早在9500年前已經(jīng)分化，至少在8300年前，南北人群融合與文化交流的進程即已開始，4800年前出現(xiàn)強化趨勢，至今仍在延續(xù)[8]。

古DNA研究不僅能夠為我們回答以上人類基因交流和遷徙的問題，還在人類健康等方面具有重要意義。古人類基因貢獻對現(xiàn)代人在適應環(huán)境和健康方面產(chǎn)生影響：現(xiàn)代人基因組中含有大量源自尼安德特人的能影響角蛋白合成的基因，從而能較快地適應歐亞大陸較冷的環(huán)境；幫助藏族人適應極高海拔環(huán)境的EPAS1基因，很有可能與丹尼索瓦人有關[3]。除了對人類自身DNA研究外，對古人類牙結石中保留的微生物DNA的研究，也能從進化角度揭示了飲食變化對人類健康狀況造成的影響[9]。另外，古DNA研究已經(jīng)成功應用于考古遺址出土沉積物中的生物古DNA信息的獲取，最近發(fā)表的有關白石崖溶洞遺址的沉積物DNA分析，為丹尼索瓦人在此長期生存的推斷提供了重要證據(jù)[10]。

結 語

隨著技術的發(fā)展，古DNA研究實現(xiàn)了從片段到基因組的突破。而針對那些古DNA特有的難題，科學家們又推出了一系列對策，如控制污染、建立文庫、基因捕獲、鑒別內(nèi)源DNA等。

隨著古DNA技術的進一步發(fā)展，希望未來能夠從更大時間與空間尺度的樣本中獲取古DNA，如特別古老的樣本、炎熱環(huán)境中保存較差的樣本、外源污染多的樣本與各類環(huán)境沉積物樣本等。古DNA研究集中了考古學、遺傳學和生物信息學等多個研究領域的優(yōu)勢，致力于各學科合作還原重大事件的源起，同時古DNA研究的發(fā)展也推動了各學科自身的進步。

[1]Higuchi R， Bowman B， Freiberger M， et al. DNA sequences from the quagga， an extinct member of the horse family. Nature， 1984， 312（5991）： 282-284.

[2]盛桂蓮， 賴旭龍， 袁俊霞， 等. 古DNA研究35年回顧與展望.中國科學：地球科學， 2016， 12： 14-28.

[3]張明， 付巧妹. 史前古人類之間的基因交流及對當今現(xiàn)代人的影響. 人類學學報， 2018， 37（2）： 206-218.

[4]Green R E， Krause J， Briggs A W， et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science， 2010， 328（5979）： 710-722.

[5]王恬怡， 趙東月， 張明， 等. 古DNA捕獲新技術與中國南方早期人群遺傳研究新格局. 人類學學報， 2020， 39（4）： 1-15.

[6]Fu Q， Meyer M， Gao X， et al. DNA analysis of an early modern human from Tianyuan Cave， China. Proc Natl Acad Sci USA， 2013， 110（6）： 2223-2227.

[7]Fu Q， Li H， Moorjani P， et al. Genome sequence of a 45，000-yearold modern human from western Siberia. Nature， 2014， 514（7523）： 445-449.

[8]Yang M A， Fan X， Sun B， et al. Ancient DNA indicates human population shifts and admixture in northern and southern China. Science， 2020， 369（6501）： 282-288.

[9]Adler C J， Dobney K， Weyrich L S， et al. Sequencing ancient calcified dental plaque shows changes in oral microbiota with dietary shifts of the Neolithic and Industrial revolutions. Nat Genet， 2013， 45（4）： 450-455.

[10]Zhang D， Xia H， Chen F， et al. Denisovan DNA in Late Pleistocene sediments from Baishiya Karst Cave on the Tibetan Plateau. Science， 2020， 370（6516）： 584-587.

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