農(nóng)業(yè)院?；A(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)和探索——以“淀粉酶活力測定”實(shí)驗(yàn)為例

易曉華YI Xiao-hua

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島266109）

0 引言

基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)是農(nóng)業(yè)院校中為農(nóng)學(xué)、園藝、植保、食品、資環(huán)、生物工程等專業(yè)開設(shè)的一門重要專業(yè)基礎(chǔ)課，旨在提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能和培養(yǎng)學(xué)生的科研素養(yǎng)。“淀粉酶活力測定”實(shí)驗(yàn)是青島農(nóng)業(yè)大學(xué)為本科生開設(shè)的基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容之一[1]，是針對生物化學(xué)理論課程中新陳代謝部分設(shè)置的實(shí)驗(yàn)，以便于通過實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐操作，讓學(xué)生掌握和理解生物體內(nèi)新陳代謝的本質(zhì)和酶的基本特性。

該實(shí)驗(yàn)采用3，5二硝基水楊酸比色法（DNS法），先提取定量小麥芽（發(fā)芽3-5天）中的淀粉酶，然后用分光光度法比色測定淀粉酶活力，實(shí)驗(yàn)既有酶的提取，又有活力測定，活力測定時(shí)既有測定管，又有對照管，還有空白管，致使很多學(xué)生錯將酶反應(yīng)中的對照管直接用作比色測定時(shí)的調(diào)零空白管，重做現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，原本并不復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)椴襟E繁雜，學(xué)生常常顧此失彼，不僅不能在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，而且嚴(yán)重的影響了學(xué)生的積極性和實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果；此外，學(xué)生操作時(shí)，往往因取材部位不同，而測定結(jié)果迥異；學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告也存在書寫混亂不規(guī)范的現(xiàn)象。鑒于此，筆者對該實(shí)驗(yàn)操作步驟做了些適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和改進(jìn)，化繁為簡，不但減少了實(shí)驗(yàn)誤差，而且提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；同時(shí)在實(shí)踐中總結(jié)出學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作中的注意事項(xiàng)，減少了學(xué)生實(shí)驗(yàn)出錯的幾率，提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果；明確了實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求和書寫格式，使學(xué)生的報(bào)告更加規(guī)范?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)的基本原理

萌發(fā)的種子中存在α-淀粉酶和β-淀粉酶兩種淀粉酶，利用β-淀粉酶耐酸不耐熱的特性，在高溫（70℃）下處理使得β-淀粉酶鈍化而測定α-淀粉酶的酶活性（α-淀粉酶耐熱不耐酸，在pH3.6下則發(fā)生鈍化），然后在不經(jīng)過高溫（70℃）處理下測得總酶的活力。

采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定。淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖能將3，5-二硝基水楊酸還原生成棕紅色的3-氨基-5-硝基-水楊酸，其顏色的深淺與麥芽糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時(shí)間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測得兩種淀粉酶的總活性。

2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

①材料：萌發(fā)3-5天的小麥，芽長1-1.5cm，根長1-3cm。②試劑：3，5-二硝基水楊酸，酒石酸甲鈉，0.4mol/L氫氧化鈉溶液，pH5.6檸檬酸緩沖液，麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）。③儀器：751分光光度計(jì)，離心機(jī)，水浴鍋，離心機(jī)，天平，容量瓶，研缽，試管（25mL）。

3 原實(shí)驗(yàn)步驟

稱取2克麥芽（全麥芽）研成勻漿后定容至50mL，離心后上清液即為酶提取液，然后分別設(shè)置反應(yīng)條件，給予α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶反應(yīng)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線做好之后，另取8只15mL試管，分別取上述反應(yīng)液各2mL，然后各管加入3，5-二硝基水楊酸2mL，煮沸5min后，冷卻后，加蒸餾水至15mL，520mn下比色，吸光值平均后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查相對應(yīng)的麥芽糖含量，帶入公式計(jì)算，求得α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶總酶的活力。

4 改進(jìn)后實(shí)驗(yàn)步驟

根據(jù)劉瑞征等報(bào)道[2]，發(fā)芽小麥胚端淀粉酶活力比后端淀粉酶活力高，故改進(jìn)后實(shí)驗(yàn)選擇稱取2克去根的麥芽，研成勻漿后定容至50mL，離心后上清液即為酶提取液，取8只25mL試管，在設(shè)置的反應(yīng)條件下反應(yīng)之后，直接向各管加入3，5-二硝基水楊酸2mL，煮沸5min后，冷卻后，加蒸餾水至25mL，520mn下比色，吸光值平均后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查相對應(yīng)的麥芽糖含量，帶入公式計(jì)算，求得α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶總酶的活力。

5 實(shí)驗(yàn)報(bào)告的規(guī)范

改進(jìn)前學(xué)生寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，沒有統(tǒng)一的要求和格式，改進(jìn)后我們統(tǒng)一了要求，規(guī)范了學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫，學(xué)生在寫報(bào)告時(shí)，便于理清思路，教師批改也更方便明了。

6 效果評價(jià)

實(shí)驗(yàn)中，小麥發(fā)芽種子的研磨、酶提取液的轉(zhuǎn)移定容、離心等實(shí)驗(yàn)操作均會損失部分提取液而帶來實(shí)驗(yàn)誤差。改進(jìn)前，用量筒測量提取液體積誤差較大，在將提取液稀釋10倍時(shí)又放大了誤差，這些都會影響到最后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果；改進(jìn)后，將量筒測量體積和稀釋兩步驟合并為用容量瓶定容一個步驟，而且用容量瓶定容體積比量筒更精確；原本要用16只15mL試管分三步進(jìn)行操作，改進(jìn)后只需用8只25mL試管一次操作，避免了反應(yīng)液轉(zhuǎn)移過程中帶來的誤差，因此，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)既簡化了實(shí)驗(yàn)操作，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間又減少了實(shí)驗(yàn)誤差，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性；另外，對學(xué)生的實(shí)驗(yàn)報(bào)告給出了明確的要求和統(tǒng)一的規(guī)范格式，既能夠幫助學(xué)生清晰實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路，更好地理解實(shí)驗(yàn)過程，便于書寫，又方便了教師批改實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

7 實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)

①嚴(yán)格控制溫度。取樣前，提前把水浴鍋的溫度調(diào)整到所需溫度；底物淀粉液、提取液、水楊酸需要40℃預(yù)熱保溫，以確保各試管反應(yīng)液溫度一致，減小誤差。

②嚴(yán)格控制時(shí)間。酶反應(yīng)時(shí)，先加底物溶液，后加酶提取液，且各管添加試劑時(shí)間和順序要一致，以避免加樣先與后的時(shí)間差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；要嚴(yán)格把握反應(yīng)時(shí)間5min，加入NaOH終止反應(yīng)要迅速，以保證反應(yīng)時(shí)間的一致性；四支測定管及空白管不要混淆。

③操作要迅速、準(zhǔn)確。研磨樣品速度要快，轉(zhuǎn)移樣品要完全，以避免樣品損失帶來的誤差；70℃水浴后要在冰浴條件下迅速冷卻，避免β-淀粉酶恢復(fù)活性而給測定帶來誤差。移液管移液要準(zhǔn)確；比色之前，一定要搖勻試管中的溶液，且要避免比色皿的差異帶來的誤差。

[1]高玲.朱新產(chǎn)等主編.基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].科學(xué)出版社，2012.6.

[2]劉瑞征，鄭慧芬.發(fā)芽小麥籽粒不同部位的α——淀粉酶活力[J].糧食儲藏，1984，03：12-14.

[3]林鉆輝，周艷華.農(nóng)業(yè)院校大學(xué)生創(chuàng)新思維培養(yǎng)研究[J].中國城市經(jīng)濟(jì)，2011（24）.