甘肅南部部分地區(qū)Q熱分子流行病學(xué)調(diào)查研究*

羅 芳 張 芳 劉增加(蘭州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心， 蘭州 730020)

Q熱是由貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii，C.b俗稱Q熱立克次體)引起的一種自然疫源性疾病。已報(bào)道的Q熱疫區(qū)遍及全球各大洲幾乎所有國(guó)家，成為當(dāng)前分布最廣的人畜共患病之一。人類和動(dòng)物對(duì)其普遍易感，可通過(guò)氣溶膠廣泛傳播，一旦流行將難以控制，因此美國(guó)反恐怖組織將其列為生物戰(zhàn)劑之一(Azadetal., 2003, 張麗娟，2007)。貝氏柯克斯體可引起人類急、慢性Q 熱，臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，60% 無(wú)任何癥狀( Karakousisetal.，2006) ,急性Q 熱常表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛，常伴有肺炎、肝炎等。因缺乏典型的臨床表現(xiàn)，因而常常被誤診為“流行性感冒”、“肺炎”、“沙門氏菌感染”、“布魯氏菌感染”和“傳染性肝炎”等，誤診率達(dá)100%(俞樹榮，2000)。

由于Q熱在我國(guó)并不是法定報(bào)告?zhèn)魅静?，因此?duì)其缺乏認(rèn)識(shí)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力不足，受感染后的病癥與其他疾病病癥的相似性，我國(guó)Q熱病例幾乎都是回顧性診斷，誤診和漏診的情況相當(dāng)嚴(yán)重(Karakousisetal., 2006; Zhangetal., 2006; 程仕虎等，2007；朱曉宇等，2008)。為了解甘肅省Q熱感染情況，我們?cè)诟拭C南部部分地區(qū)從媒介動(dòng)物及當(dāng)?shù)厝巳簝蓚€(gè)方面展開調(diào)查，以期明確該病在西北地區(qū)的分布及分析人群感染的潛在危險(xiǎn)因素。

1 材料與方法

1.1 采集地點(diǎn)

調(diào)查點(diǎn)為甘肅省岷山北麓地區(qū)，采樣時(shí)間為2009年4～6月及2013年5月。

1.2 標(biāo)本的采集

蜱標(biāo)本：采用布旗法，分類鑒定后保存待用。人群血標(biāo)本：當(dāng)?shù)鼐用裨谥橥獾那闆r下，按項(xiàng)目預(yù)先設(shè)計(jì)的調(diào)查表登記被調(diào)查對(duì)象的相關(guān)資料。資料包括性別、年齡、職業(yè)等；相關(guān)的危險(xiǎn)因素主要為：(1) 家中是否飼養(yǎng)牛羊； (2)家中牛羊是否有不明原因的流產(chǎn)；(3)牛羊生產(chǎn)過(guò)程中是否自己接生；(4)接生過(guò)程中是否采取保護(hù)措施(如戴口罩等)。在調(diào)查登記中上述相關(guān)危險(xiǎn)因素中如滿足第1條則繼續(xù)后2～4條的填寫，如不滿足，則終止。填寫相關(guān)調(diào)查表后，從被調(diào)查對(duì)象肘靜脈處采靜脈血3 mL，靜置或離心分離出血清后置4 ℃冰箱待檢，家畜(牛、羊)血標(biāo)本：靜脈血5 mL，靜置或離心分離出血清后置4 ℃冰箱待檢。鼠標(biāo)本：鼠標(biāo)本采用夾夜法，誘捕不同生境下的野棲鼠。所獲標(biāo)本經(jīng)鼠種鑒定后現(xiàn)場(chǎng)無(wú)菌解剖，取組織置-20℃保存待用。

1.3 細(xì)菌DNA的提取

鼠標(biāo)本中病原體DNA的提?。航?jīng)鼠種鑒定后，無(wú)菌操作剪取約3 mm3(約500 mg)大小的脾組織，置滅菌研磨器中加入Trizol，充分研磨后移入Eppendorf管中；通過(guò)離心分離去除RNA后，通過(guò)2次洗滌(0.1 mol/L 檸檬酸鈉10%乙醇溶液)后獲得DNA沉淀，然后將其懸于75%酒精中靜置10～20 min。2～8℃, 2 000×g離心5 min, 然后將DNA沉淀溶于8 mmol/L NaOH溶液中，4℃過(guò)夜。最后將提取好的DNA溶于TE (0.01 mol/L, pH 8.0) 中，紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度及純度后置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

蜱標(biāo)本中病原體DNA的提?。航?jīng)蜱種鑒定后，用75%酒精浸泡20 min 后，用無(wú)菌濾紙吸干，再用生理鹽水，漂洗3 次，用無(wú)菌濾紙吸干蜱體表水份后，置EP管中，加入 DNA提取緩沖液 (10 mmol/L Tris, pH 8.0, 2 mmol/L EDTA, 0.1% SDS, 500 μg of proteinase K/mL) 50～200 μL, 用滅菌的槍頭進(jìn)行充分研磨, 后56℃孵育2 h, 置沸水中煮10 min 后置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原體的檢測(cè)

針對(duì)C.b的23S rRNA 基因序列，采用巢式PCR法擴(kuò)增(陳榮等，2001)第1對(duì)引物為C.b23S IVSF/R，第2對(duì)引物為Cb IVSF/R，Cb 23S IVSF：5′-CTTTAAAGAAAGCCTAATAG-3′， Cb 23S IVSR: 5′-TTACTTTATGTCAGCATTCG-3′，Cb IVSF: 5′-TCACTGGTCGAGTCGTC-3′Cb IVSR: 5′-ATTCGCACTTCTGATACC-3′。反應(yīng)條件：兩輪擴(kuò)增條件一樣。擴(kuò)增條件：94℃ 3 min；94 ℃ 60 s, 55℃ 60 s, 72℃ 60 s, 30個(gè)循環(huán), 最后72 ℃ 5 min。第2輪擴(kuò)增：取第1輪產(chǎn)物2 μL 為模板，反應(yīng)體系和條件同第一輪。最終目的片段大小為600 bp左右。

1.5 血清學(xué)檢測(cè)方法

間接免疫熒光法檢測(cè)(Setiyonoetal., 2005)：采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所制備的抗原片，過(guò)程簡(jiǎn)述如下：將血清用PBS (0.01 mol/L pH 7.4)從1：16 開始倍比稀釋，取稀釋好的血清滴加于抗原片孔中，37 ℃孵育45 min，取出用PBS (0.01 mol/L, pH 7.4)及蒸餾水沖洗晾干，檢測(cè)人群血清時(shí)點(diǎn)上FITC標(biāo)記的抗人Ig G抗體，檢測(cè)牛血清時(shí)點(diǎn)FITC標(biāo)記的抗牛Ig G抗體，檢測(cè)羊血清時(shí)點(diǎn)FITC標(biāo)記的抗羊Ig G抗體，37 ℃孵育45 min，沖洗晾干后，置熒光顯微鏡下觀察，血清效價(jià)為≥1：80者可判為血清抗體陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較不同地區(qū)、不同職業(yè)陽(yáng)性率的差異；相關(guān)危險(xiǎn)因素分析,采用非條件logistic 回歸計(jì)算各危險(xiǎn)因素與血清陽(yáng)性發(fā)生的聯(lián)系強(qiáng)度,用比值比(odds ratio, OR)表示，統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS (10.0)軟件。

2 結(jié)果

2.1 蜱中Q熱立克次體感染情況

森林革蜱Dermacentorsilvarum、草原革蜱D.nuttalli、達(dá)吉克斯坦硬蜱D.daghestanicus及日本血蜱Haemaphysalisjaponica4個(gè)蜱種1 273只蜱標(biāo)本，其中若蜱1 126只，均為日本血蜱；成蜱147只，其中森林革蜱56只，日本血蜱10只，草原革蜱56只，達(dá)吉斯坦硬蜱25只。將若蜱按不同種類每20只左右為一組進(jìn)行處理和檢測(cè)，共分為67組，有5組檢測(cè)到Q熱DNA片段(圖1)。147只成蜱中7只森林革蜱、7只草原革蜱、及3只日本血蜱檢測(cè)陽(yáng)性，成蜱總陽(yáng)性率為11.56%。

圖 1 蜱標(biāo)本中病原體擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR results from tick samples M： 分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1：陰性對(duì)照； 2～4：陽(yáng)性標(biāo)本。 M: 100bp ladder Marker; 1: Negative control; 2-4: Postive sample.

2.2 當(dāng)?shù)鼐用窀腥厩闆r

共采集當(dāng)?shù)鼐用裱鍢?biāo)本446份，受檢對(duì)象年齡在15～75歲之間，其中男性229例，女性217例，職業(yè)主要包括職工、農(nóng)民、牧民等，各家飼養(yǎng)家畜(豬、牛、羊)及家禽(雞)較普遍。牧民家主要飼養(yǎng)牛、羊。此次共檢測(cè)到陽(yáng)性標(biāo)本29份，總陽(yáng)性率為6.50%，不同職業(yè)陽(yáng)性率存在差異(χ2=37.64,P=0.00),以牧民的陽(yáng)性率為最高，達(dá)到25.42%(表1)。

2.3 家畜感染情況

共采集家畜血液標(biāo)本326份，其中牛56份，檢測(cè)陽(yáng)性5份，羊270份，陽(yáng)性29份，二者未見(jiàn)明顯差別。

2.4 野棲鼠感染情況

共捕獲大林姬鼠Apodemuspeninsulae(12只)、黑線姬鼠A.agrarius(11只)、小林姬鼠A.sylvaticus(10只)及灰倉(cāng)鼠Cricetulusmigratorius(9只)4個(gè)鼠種42只野鼠，其中大林姬鼠2只，灰倉(cāng)鼠1只，共計(jì)3只檢測(cè)陽(yáng)性。

表 1 不同人群血清檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of IFA from different occupation

2.5 相關(guān)危險(xiǎn)因素分析

對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行單因素分析，發(fā)現(xiàn)家中是否飼養(yǎng)牛羊、牛羊是否有不明原因流產(chǎn)、接生是時(shí)是否采取保護(hù)措施，上述3個(gè)因素與血清陽(yáng)率有關(guān)，其中前兩個(gè)因素為危險(xiǎn)因素，而接生時(shí)是否采取保護(hù)措施為保護(hù)因素(表2)。

表2 血清陽(yáng)性相關(guān)因素的單因素分析結(jié)果Tab.2 Association analyses of seropositive with risk factors

3 討論

自1937年Q熱(“Q”是Query的第1個(gè)字母，意為疑問(wèn))在澳大利亞被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)(Bacaetal.，1983)目前已報(bào)道的Q熱疫區(qū)幾乎遍及全球各大洲所有的國(guó)家，Q熱已經(jīng)成為當(dāng)前分布最廣的人獸共患病之一。在我國(guó)經(jīng)血清流行病學(xué)調(diào)查和病例證實(shí)，Q熱分布遍及北京、河北、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、四川、重慶、云南、廣東、廣西、海南、山東、江蘇、安徽、福建、甘肅、新疆及西藏等二十余省市自治區(qū)，其中內(nèi)蒙、四川、新疆、云南及西藏等地區(qū)還發(fā)生過(guò)Q熱的暴發(fā)流行(俞樹榮, 2000)。本研究在甘肅南部農(nóng)牧業(yè)區(qū)選點(diǎn)，從媒介、宿主及人群進(jìn)行系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查研究，證實(shí)了該病在調(diào)查點(diǎn)的存在；同時(shí)通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)了存在的相關(guān)危險(xiǎn)因素，為該疾病的有效預(yù)防提供了數(shù)據(jù)支持。

Q 熱在我國(guó)不屬于法定報(bào)告?zhèn)魅静?，目前，我?guó)仍缺乏詳實(shí)的 Q 熱全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查資料。而其病原體具有毒力強(qiáng)，一個(gè)菌即可使人感染的特點(diǎn)，因此被列入重要的生物戰(zhàn)劑而備受關(guān)注。Q熱又是一種重要的自然疫源性疾病，其在自然界中的宿主種類廣泛，包括野生及家養(yǎng)的哺乳動(dòng)物、鳥類及多種節(jié)肢動(dòng)物。而在動(dòng)物間的傳播媒介主要為蜱，且可以經(jīng)卵傳播，保證了自然疫源地長(zhǎng)期存在。牛、羊、家畜、鳥、野生嚙齒動(dòng)物以及蜱是該病原體的主要儲(chǔ)存宿主( Eklundetal.,1947; Buhariwallaetal., 1996; Brouquietal., 1997)。本研究從媒介、宿主及人群3個(gè)方面系統(tǒng)地進(jìn)行調(diào)查研究，在所調(diào)查的4個(gè)蜱種中有3個(gè)蜱種檢測(cè)到Q熱立克次體DNA片段，值得注意的是本研究首次從若蜱中檢測(cè)到病原體DNA片段，這有可能是若蜱機(jī)械攜帶，但亦有可能提示病原體可以經(jīng)期傳播，這需要在今后的工作中進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。野生嚙齒動(dòng)物亦是Q熱立克次體的主要儲(chǔ)存宿主，在我國(guó)目前證明了野生小哺乳動(dòng)物中的喜馬拉雅旱獺、藏鼠兔、達(dá)烏利亞黃鼠、黃胸鼠有感染，本研究從捕獲的黑線姬鼠及大林姬鼠體內(nèi)檢測(cè)到病原體DNA，但其在Q熱疫源地中保持和傳播病原體方面所起的作用，有待進(jìn)一步研究。

人類感染的主要途徑是氣溶膠感染 (Maurinetal.,1999)，其次是消化道，易于接觸感染動(dòng)物的人群如農(nóng)民、畜牧業(yè)工作者、實(shí)驗(yàn)室人員、肉類加工者等。人感染Q熱后常表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛，因缺乏典型的臨床表現(xiàn)，臨床上多誤診為“流行性感冒”等等，而動(dòng)物感染Q熱后多呈亞臨床經(jīng)過(guò)，動(dòng)物有時(shí)出現(xiàn)食欲不振，體重下降，產(chǎn)奶量減少和流產(chǎn)、死胎等現(xiàn)象，由此可以看出該病具有很大的隱匿性，不容易被人們所認(rèn)識(shí)，本研究中在對(duì)當(dāng)?shù)鼐用竦难鍖W(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，其陽(yáng)性率為6.58%，說(shuō)明當(dāng)?shù)鼐用裰杏懈腥菊撸绕涫悄撩瘢溲尻?yáng)性率最高，達(dá)到25.26%，其原因可能其暴露機(jī)會(huì)高。在同時(shí)開展的相關(guān)危險(xiǎn)因素中調(diào)查發(fā)現(xiàn)：家中是否飼養(yǎng)牛羊、牛羊是否有不明原因流產(chǎn)是人群血清陽(yáng)性發(fā)生的危險(xiǎn)因素，家中飼養(yǎng)的家畜越多，家庭成員接觸的機(jī)會(huì)也越多，其感染的機(jī)會(huì)也就越高；同時(shí)家畜不明原因流產(chǎn)有可能就是感染了Q熱而造成的，這樣亦使接觸者感染的機(jī)會(huì)增加。事實(shí)上已有研究闡明：Q熱有因孕獸分娩、屠宰旺季等因素而呈現(xiàn)季節(jié)性上升或暴發(fā)的現(xiàn)象，亦有研究從動(dòng)物的胎盤中分離獲得了Q熱病原體，本研究中的相關(guān)因素分析中發(fā)現(xiàn)：接生時(shí)是否采取保護(hù)措施為Q熱血清陽(yáng)性的保護(hù)性因素，因此在動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中，采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施將有利于預(yù)防疾病的發(fā)生。

Q熱雖然病死率低，但其病原體的感染力和在外環(huán)境中的抵抗力都很強(qiáng)，極易傳播；而且牛、羊等家畜感染及畜產(chǎn)品的污染又會(huì)導(dǎo)致衛(wèi)生學(xué)方面的問(wèn)題。目前我國(guó)可能仍有許多急性和慢性Q熱病人未得到正確診斷和及時(shí)治療，如不加以重視，一旦疫情蔓延，有可能影響社會(huì)穩(wěn)定和造成經(jīng)濟(jì)損失。