巢式-PCR檢測蜱體中土拉弗氏菌的fopA基因及血清學(xué)調(diào)查*

李志清 劉增加 上官改珍 何 瑩巨 敏 李旭光 胡良煜 徐 燕

(1.解放軍第323醫(yī)院，西安 710054； 2.蘭州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，蘭州 730020)

土拉菌病又稱“野兔熱”，是由土拉弗氏菌Francisellatularensis經(jīng)患病野生動物、吸血節(jié)肢動物或遭受污染的水或食物傳播的一種自然疫源性疾病，呈世界性分布(Dennisetal., 2001; T?rnviketal., 2003)。土拉弗氏菌在自然界的宿主主要包括節(jié)肢類和哺乳類動物，如：蜱類、野兔類、鼠類等(Fulopetal., 1996)。在中國，土拉弗氏菌最早在1957年從黃鼠體內(nèi)就分離得到。1959年黑龍江省報道了第一起人間感染野兔熱(康成貴，1980)。隨后證實西藏、新疆、甘肅等地存在土拉弗氏菌病的自然疫源地(郭從厚等，1981；孔昭敏等，1984；劉增加等，1995)。陜西省地處西北地區(qū)中部，與甘肅省毗鄰，生態(tài)環(huán)境、自然資源與甘肅省十分相像，然而，陜西省并未開展此方面的研究，目前尚不清楚該病是否在陜西省存在。為此，2012年4月至2013年8月我們對陜西省部分地區(qū)土拉弗氏菌的自然感染作了調(diào)查研究，首先應(yīng)用巢式PCR技術(shù)對蜱體內(nèi)攜帶土拉弗氏菌進行檢測，以了解陜西省蜱體中自然感染土拉弗氏菌的狀況，同時收集調(diào)查地區(qū)人群的血清標本進行血清學(xué)檢測，以明確人群血清土拉弗氏菌的抗體狀況。此外，我們應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列(Short sequence tandem repeat, SSTR)多態(tài)性對檢測陽性的標本進行基因分型，結(jié)合流行病學(xué)資料研究基因型與地理分布、媒介蜱種等方面的關(guān)系，為陜西省土拉弗氏菌病的分子流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病原分子生物學(xué)檢測

1.1.1標本采集：調(diào)查地點：陜西省調(diào)查點包括富縣、隴縣，屬于子午嶺山區(qū)。蜱標本的采集：采用布旗法收集游離蜱標本，分類鑒定后保存待用。血標本的采集：采集當?shù)鼐用裱簶吮?，在知情同意的情況下，從被調(diào)查對象肘靜脈處采靜脈血5 mL，靜置或離心分離出血清后置4℃冰箱待檢。

1.1.2病原體DNA的提取: 蜱標本中病原體DNA的提取，將已定種的單只蜱標本，用75%酒精浸泡20 min，用無菌濾紙吸干，用生理鹽水漂洗3次，用無菌濾紙吸干蜱體表水份，置EP管中，加入DNA提取緩沖液 (10 mmol/L Tris, pH 8.0, 2 mmol/L EDTA, 0.1% SDS, 500 μg of proteinase K/mL) 200 μL，用滅菌的槍頭進行充分研磨，置56 ℃孵育2 h，置100 ℃水中煮10 min，移至4 ℃離心機中,5 000 r/ min 離心5 min,上清液于- 20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3PCR擴增: 標本使用4對引物檢測(表1)，其中FNA8L/FNA2L及FNA7L/FNA1L為兩對巢式PCR引物，擴增土拉弗菌的fopA基因(Fulopetal., 1996)；C6/C8引物為種特異性引物，通過擴增片段的長度不同來區(qū)分土拉弗菌A、B兩亞種。對fopA基因擴增陽性的標本采用9F/9R引物擴增土拉弗氏菌基因中的SSTR9區(qū)進行基因型擴增。所用引物由TaKaRa公司合成。所有擴增均在ABI2700 PCR儀上進行。

表 檢測用引物序列及PCR反應(yīng)條件Tab.1 Primers and PCR condition used in the study

* A亞種擴增片段長度為250 bp，B亞種為220 bp。

1.2 血清學(xué)檢測

在采樣地點收集當?shù)鼐用竦难鍢吮?，進行血清學(xué)檢測。利用膠體金試紙條(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所研制)檢測人群血清中土拉弗氏菌IgG抗體。

1.3 統(tǒng)計分析

應(yīng)用χ2檢驗比較不同地區(qū)、不同媒介感染率的差異性，統(tǒng)計處理應(yīng)用SPSS (9.0)軟件。

2 結(jié)果

2.1 蜱中土拉弗氏菌的檢測

陜西省富縣、隴縣共采集3個蜱種：達吉斯坦革蜱Dermacentorqinghaiensis、日本血蜱Haemaphysalisjaponica、嗜群血蜱H.concinna，共1 116只蜱標本。共有3個蜱種25只蜱標本檢測陽性(擴增出400 bp左右片段，圖1)，總陽性率為2.24%。不同蜱種陽性率有差別(χ2=20.91，P=0.00)，其中以日本血蜱的陽性率最高，達到15.39%(表2)。

2.2 土拉弗氏菌亞種鑒定

采用亞種特異性引物(C6/C8)對擴增陽性的標本進行土拉弗氏菌的亞種鑒定，所有陽性標

圖1 蜱標本中土拉弗氏菌擴增陽性結(jié)果Fig. 1 The result of positive samples 1: 陰性對照；2～4，9～13：檢測陰性標本； 5,7,8：檢測陽性標本，6：100 bp ladder Marker。 1: Negative control; 2-4,9-13: Negative sample; 5,7,8: Positive samples; 6: 100 bp ladder Marker.

表2 陜西省富縣、隴縣不同蜱種土拉弗氏菌感染檢測結(jié)果弗氏菌感染檢測結(jié)果Tab.2 Prevalence of F. tularensis in ticks

本擴增出220 bp條帶。25份標本中選取10份，其中達吉斯坦革蜱3份，日本血蜱2份、嗜群血蜱5份，進行序列測序，獲得核酸序列，經(jīng)在檢索，與GenBank數(shù)據(jù)庫中土拉弗氏菌holarctica 亞種參考菌株序列AF247690.2 100%同源。

2.3 陽性標本SSTR9位點的分析

SSTR9區(qū)域是一9 bp(AAAACAAAGAC、AATAAGGAT及AATAAAGAC三種組合方式)的重復(fù)單元，有不同的序列組合，但此位點雖然存在不同的序列組合，但其并不影響氨基酸的排列。對25份陽性標本進行擴增，其中5份標本未擴增出目的片段，20份標本擴增出目的片段。SSTR9區(qū)共有6種不同的拷貝數(shù)分別為7，8，9， 16，18及21(圖2)。這表明此位點存在6種不同的基因型，6種基因型中以拷貝數(shù)為9的占多數(shù)(40.00%)。

圖2 SSTR9區(qū)擴增結(jié)果Fig. 2 The results of SSTR9 region 1：陰性對照；2：50 bp Marker; 3-8:不同基因型 1: Negative; 2: 50 bp Marker: 3-8: Different genotype.

2.4 基于SSTR9區(qū)序列陽性標本聚類分析

基于陽性標本的SSTR9區(qū)序列， 利用Plylip3. 63 軟件包中SEQBOOT 分析，重復(fù)數(shù)為1 000；然后采用Jukes-cantor 距離模式，選用Neighbor-Joining(NJ)建樹方法，依次運用DNADIST、NEIGHBOR 和CON-SENSE 程序得到系統(tǒng)發(fā)生樹。20份標本主要分為兩大群(圖3)。

圖3 基于SSTR9區(qū)的聚類分析Fig.3 The cluster analysis based on SSTR9 region

2.5 血清學(xué)檢測

陜西省富縣、隴縣土拉弗氏菌病血清流行病學(xué)調(diào)查共采集到當?shù)鼐用裱鍢吮?25份，檢測土拉弗氏菌病血清IgG抗體，陽性者37份，陽性率為5.10%(表3)。

表3 不同地區(qū)人群土拉弗氏菌病血清學(xué)檢測結(jié)果Tab.3 The seroprevelence of tularemia from different regions

3 討論

土拉弗氏菌傳染力、致病力強，易于傳播，美國等許多西方國家已將其與炭疽、鼠疫、天花等一起列入A類生物恐怖病原，而我國一直未引起足夠重視。本研究首次在陜西省子午嶺山區(qū)從蜱中檢測到土拉弗氏菌DNA片段，并發(fā)現(xiàn)當?shù)厝巳褐幸嘤懈腥菊?，這些證據(jù)在一定程度上說明陜西省可能存在土拉弗氏菌的自然疫源地，目前迫切需要從病原學(xué)、媒介、宿主動物等多方面進行詳盡的流行病學(xué)調(diào)查，以闡明該病在陜西的分布及流行病學(xué)特征；對疫源地應(yīng)進行長期監(jiān)測，了解其變化情況，并采取積極的措施防患于未燃。

相關(guān)研究顯示土拉弗氏菌主要分布在北緯30°以北的廣大地區(qū)(Dennisetal., 2001)，我國許多省區(qū)都位于該范圍之內(nèi)，其中包括陜西省。本研究共調(diào)查檢測了4個蜱種1 117只蜱標本，總陽性率為2.24%，其中以日本血蜱的陽性率為最高，達到15.39%，不可否認的是此數(shù)據(jù)可能存在偏移，因其采集的數(shù)量有限，同時目前尚不能確定日本血蜱為其媒介，相關(guān)的傳播動力學(xué)實驗尚未開展，今后應(yīng)擴大此蜱種的樣本量，并從傳播動力學(xué)方面開展相關(guān)研究以闡明上述問題。

研究共采集到當?shù)鼐用裱鍢吮?25份，共有37份標本顯示為陽性，總陽性率為5.10%，這說明當?shù)鼐用裰写嬖谧匀桓腥镜那闆r，這在一定程度上更加說明了該病在陜西省的存在，一直沒有病例報告，究其原因可能一方面大多數(shù)人并不了解該病，其癥狀不典型而被誤診或漏診；另一方面，該病治療簡單，對普通抗生素有效而未上報。事實上，該病在陜西省的存在并不奇怪，陜西省與甘肅省鄰近，兩地區(qū)的自然環(huán)境亦非常相似，而后者早就有該病的報道，今后應(yīng)系統(tǒng)地開展土拉弗氏菌病的相關(guān)研究。

土拉弗氏菌包括4個亞種, 各亞種在地理分布、宿主動物、毒力及傳播途徑等流行病學(xué)特征方面差異較大。其中土拉弗氏菌土拉亞種即A亞種和土拉弗氏菌全北區(qū)即B亞種是主要的分離株,人間土拉菌病的爆發(fā)大多數(shù)與這兩個亞種有關(guān)。A亞種為高毒亞種，10個菌體即可引起人或動物(如家兔)致病，幾乎嚴格分布于北美。B亞種毒力較A亞種弱，家兔對其敏感性較小，一般達109～1 010個/mL方可引起家兔死亡，B亞種主要分布在歐洲和亞洲,也見于北美部分地區(qū)。中國目前所有分離株經(jīng)生化、毒力檢測等均判定為B亞種。雖然土拉弗菌主要有2個亞種，但亞種內(nèi)變異和差別較大，當疾病發(fā)生時病原體的快速溯源尤為重要，此時快速高效的分析方法往往起到事半功倍的效果。短串聯(lián)重復(fù)序列是DNA復(fù)制過程中鏈滑動的結(jié)果，在原核和真核生物中廣泛存在，以該序列多態(tài)性為基礎(chǔ)的分型方法已被成功地應(yīng)用于多種病原體的分型。Johanson等(2004)已成功地將此法應(yīng)用于土拉弗氏菌，取得了較好的效果。本研究中利用該方法，選取最常用的兩個基因區(qū)，對檢測陽性的標本進行基因型別分析。研究結(jié)果顯示盡管檢測到的土拉弗氏菌均為B亞種，但存在6種不同的基因型別，這也說明陜西省土拉弗氏菌基因型別的多樣性。聚類分析結(jié)果顯示出了陽性標本基因型別與地域分布有一定的關(guān)聯(lián)的特點，這可能與蜱種的地區(qū)分布特點有關(guān)，這與Goethert(2004)的研究結(jié)果一致。由于本研究中陽性標本數(shù)量有限，目前的研究結(jié)果尚達不到根據(jù)地區(qū)準確劃分基因型的要求，今后擴大采樣，擴大陽性標本的數(shù)量，甚至分離病原體可能利于該問題的闡明。但本研究的結(jié)果提示了我國西北地區(qū)的土拉弗氏菌基因型別的復(fù)雜性和系統(tǒng)地開展相關(guān)研究的必要性。