穴位埋線對(duì)慢傳輸型便秘大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響

尹平,徐世芬,高寧陽(yáng),吳君怡,朱博暢

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071;2.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所,上海 201203)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)是一類(lèi)以結(jié)腸傳輸減慢為特點(diǎn)的頑固性便秘,約占功能性便秘的45.5%,臨床上最為常見(jiàn)[1]。STC病程較長(zhǎng),內(nèi)科各種保守治療措施效果有限,大多數(shù)患者需要長(zhǎng)期依賴(lài)各種刺激性瀉劑排便,部分患者最終需手術(shù)切除傳輸遲緩的結(jié)腸方能解除癥狀[2]。所以,探尋其有效的治療方法是我們醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究方向。近年來(lái),較為統(tǒng)一的研究觀點(diǎn)認(rèn)為Cajal間質(zhì)細(xì)胞在結(jié)腸中的分布和功能異?？赡苁荢TC結(jié)腸慢波頻率減慢的直接或間接原因。而穴位埋線作為目前臨床治療STC的有效方法之一,兼具操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)省時(shí)、易于患者接受的特點(diǎn)。故本研究擬通過(guò)觀察穴位埋線對(duì)STC模型大鼠腸道傳輸功能及其結(jié)腸組織 Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響,探討穴位埋線治療STC的可能作用機(jī)制及不同穴位調(diào)節(jié)STC的穴位特異性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠34只,體質(zhì)量(180±10)g,雌雄各半,由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)2008-0016。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期(14 h光照、10 h黑夜),室內(nèi)溫度(20±2)℃,濕度(50±10)%,標(biāo)準(zhǔn)飼料,高壓滅菌墊料和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心許可證號(hào)為SYXK(滬)2004-0005。

1.2 主要試劑及器材

冰凍包埋切片機(jī)(CM3050S,德國(guó) Leica),倒置顯微鏡(1X71,日本 Olympus),電熱恒溫水浴鍋(DK-S26型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),電子天平(JA10002,上海精天電子儀器有限公司),兔多抗 c-kit抗體(一抗)(美國(guó)abcam公司),SABC(兔IgG)-POD kit試劑盒(免疫組化試劑盒)(北京索萊寶科技有限公司),大黃顆粒劑(產(chǎn)品批號(hào)為 1106202,江陰天江藥業(yè)有限公司),無(wú)菌注射針(規(guī)格 ?0.7×32 TWLE,上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司),醫(yī)用羊腸線(規(guī)格為 3～0,B30,鉻制,上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司),平頭毫針(規(guī)格0.30 mm×50 mm,無(wú)錫佳健醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

將34只SD大鼠隨機(jī)分為5組,即正常組(6只)、模型組(7只)、天樞組(7只)、上巨虛組(7只)及大腸俞組(7只)。

1.3.2 模型制備

參照文獻(xiàn)[3]方法,模型組、天樞組、上巨虛組及大腸俞組每只大鼠給予每日灌服大黃粉懸液,首次大黃用量為200 mg/(kg·d),以此遞增直至出現(xiàn)半數(shù)大鼠糞便變稀,然后保持此劑量至80%的稀便消失,然后再在此基礎(chǔ)上按200 mg/(kg·d)遞增給藥,直到又有近半數(shù)大鼠出現(xiàn)腹瀉,如此循環(huán)3次,待最后1次80%稀便消失,然后停止給藥1星期,從而誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性STC大鼠模型。采用首粒黑便排出時(shí)間判定模型成功建立與否。

1.3.3 穴位選擇及處理方法

天樞、上巨虛、大腸俞穴位定位參照林文注主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]。

天樞組、上巨虛組及大腸俞組每只大鼠,在造模成功的基礎(chǔ)上,分別給予天樞、上巨虛及大腸俞穴位埋線處理,每7 d治療1次,4次為1個(gè)療程,共計(jì)28 d。

穴位埋線操作方法,先將“3～0”醫(yī)用羊腸線剪成長(zhǎng)度約為0.5 cm的線段若干,置于消毒彎盤(pán)中,然后將羊腸線從注射針的針尖處穿入(此時(shí)線頭與針尖內(nèi)緣齊平)。消毒穴位區(qū)相應(yīng)皮膚,然后將無(wú)菌注射針刺入相應(yīng)穴位到達(dá)預(yù)定深度,先稍稍后退針,隨后用手指抵住毫針針尾做注射狀,緩慢將羊腸線推入穴位內(nèi),當(dāng)注射針內(nèi)有空虛感時(shí),方可出針,并確認(rèn)羊腸線已埋入大鼠肌內(nèi),埋線完畢,大鼠穴位處無(wú)需特殊處理。

1.3.4 組織取材

治療結(jié)束后,各組大鼠均禁食、不禁水24 h。采用100 g/L活性碳懸液2 mL灌胃30 min后,頸椎脫臼法處死。剖腹立即取距盲腸端2 cm處結(jié)腸組織約1 cm,用預(yù)冷生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物,裝入預(yù)先標(biāo)記分組的凍存管后迅速投入液氮,于﹣70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 觀察指標(biāo)及測(cè)試方法

1.3.5.1 大鼠6 h內(nèi)首粒黑便排出時(shí)間、大便重量及碳推進(jìn)百分率(%)

采用活性碳灌胃法測(cè)定,經(jīng)口灌入100 g/L的活性碳懸液2 mL,并將大鼠分別予代謝籠里觀察,從活性碳灌胃完畢開(kāi)始計(jì)時(shí),記錄從灌胃到大鼠首粒黑便排出時(shí)間,6 h內(nèi)大便重量。

采用活性碳推進(jìn)試驗(yàn)檢測(cè)腸道傳輸功能,碳推進(jìn)百分率(%)=(碳末前端與幽門(mén)的距離/腸道全長(zhǎng))×100%。摘除從幽門(mén)到直腸末端的全部腸道,在松弛狀態(tài)下測(cè)量腸道的全長(zhǎng)及活性碳懸液在腸道內(nèi)推進(jìn)的長(zhǎng)度,并計(jì)算活性碳懸液推進(jìn)長(zhǎng)度與腸道全長(zhǎng)的百分比。

1.3.5.2 Cajal間質(zhì)細(xì)胞的免疫組化染色

結(jié)腸組織用OCT包埋后放于冰凍切片機(jī)中,每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片3張,片厚5 μm,按照SABC(兔IgG)-POD kit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。切片于PBS緩沖液浸泡5 min,枸櫞酸鈉熱修復(fù)抗原,自然冷卻3～5 min后,PBS緩沖液浸泡5 min。置3%雙氧水中孵育10 min,用PBS緩沖液沖洗2 min×3次。滴加適當(dāng)稀釋的兔抗鼠多克隆c-kit抗體(按1:200稀釋),濕盒內(nèi)﹣4℃孵育過(guò)夜,PBS緩沖液沖洗2 min×3次。滴加二抗,室溫孵育30 min,PBS緩沖液沖洗2 min×3次。DAB顯色10 min,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染5 min,常規(guī)脫水,封片。在Olympus(1X71)型熒光倒置相差顯微鏡下,每張切片隨機(jī)選3個(gè)高倍鏡視野(10×40)觀察,應(yīng)用Image-Pro Plus 5.0圖形分析系統(tǒng)拍照并計(jì)算Cajal間質(zhì)細(xì)胞免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用One-way-ANOVA單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì),P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠6 h內(nèi)首粒黑便排出時(shí)間、大便重量及碳推進(jìn)百分率的比較

由表1可見(jiàn),大鼠6 h內(nèi)首粒黑便排出時(shí)間,模型組、大腸俞組(P＜0.01)及上巨虛組(P＜0.05)均高于正常組;天樞組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);天樞組、上巨虛組、大腸俞組均低于模型組(P＜0.01);上巨虛組、大腸俞組均高于天樞組(P＜0.01)。6 h內(nèi)大便重量,模型組低于正常組(P＜0.01);天樞組、上巨虛組、大腸俞組均高于模型組(P＜0.01);上巨虛組、大腸俞組與天樞組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。碳推進(jìn)百分率(%),模型組、大腸俞組(P＜0.01)及上巨虛組(P＜0.05)皆低于正常組;天樞組、上巨虛組、大腸俞組均高于模型組(P＜0.01);大腸俞組碳推進(jìn)百分率(%)低于天樞組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠6 h內(nèi)首粒黑便排出時(shí)間、大便重量及碳推進(jìn)百分率的比較 (±s)

表1 各組大鼠6 h內(nèi)首粒黑便排出時(shí)間、大便重量及碳推進(jìn)百分率的比較 (±s)

注:與正常組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較3)P＜0.01;與天樞組比較4)P＜0.05,5)P＜0.01

組別 n 首便時(shí)間(min)6 h大便重量(g)百分率(%)正常組 6 195.17±22.36 6.83±1.24 67.94±2.26模型組 7 308.00±28.132) 4.30±0.452) 50.89±6.252)天樞組 7 194.14±14.113) 7.04±0.903) 65.52±5.163)上巨虛組 7 227.14±15.431)3)5) 7.01±0.863) 61.55±3.551)3)大腸俞組 7 233.14±20.602)3)5) 6.83±0.763) 59.94±6.442)3)4)

2.2 穴位埋線對(duì)大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響

正常組相鄰Cajal間質(zhì)細(xì)胞呈帶狀或網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),胞體呈紡錘形或梭形;模型組Cajal間質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞,分布不連續(xù),形態(tài)也多異常;經(jīng)4次穴位埋線治療后,天樞組、上巨虛組、大腸俞組大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)分布及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)多與正常組接近。模型組與正常組相比,大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量明顯減少(P＜0.01)。天樞組、大腸俞組(P＜0.01)和上巨虛組(P＜0.05)與模型組相比,大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量均明顯增加。天樞組與上巨虛組、大腸俞組相比,大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增加較明顯(P＜0.01)。大腸俞組與上巨虛組相比,大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增加較明顯(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞的變化(免疫組化,×400)

表2 各組大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的比較(±s)

表2 各組大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的比較(±s)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.05,3)P＜0.01;與天樞組比較4)P＜0.01;與上巨虛組比較5)P＜0.05

組別 n 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè))正常組 6 67.17±4.96模型組 7 38.86±3.291)天樞組 7 53.86±3.291)3)上巨虛組 7 43.57±2.441)2)4)大腸俞組 7 47.43±2.941)3)4)5)

3 討論

目前,有關(guān)STC的發(fā)生機(jī)理尚不十分明確,對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在腸道形態(tài)學(xué)的改變和胃腸神經(jīng)肽的改變方面。近年來(lái),較為統(tǒng)一的研究觀點(diǎn)認(rèn)為Cajal間質(zhì)細(xì)胞在結(jié)腸中的分布和功能異?？赡苁荢TC結(jié)腸慢波頻率減慢的直接或間接原因。結(jié)腸組織中的Cajal間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量、體積和超微結(jié)構(gòu)的改變,引起異常的不規(guī)則慢波,由此誘發(fā)的動(dòng)作電位使平滑肌產(chǎn)生不規(guī)則的或無(wú)效的收縮,使結(jié)腸功能紊亂,運(yùn)轉(zhuǎn)緩慢,糞便通過(guò)時(shí)間延長(zhǎng),導(dǎo)致慢傳輸型便秘的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)[5],STC患者結(jié)腸平滑肌內(nèi)有大量包涵體形成,而它的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致平滑肌收縮性下降,進(jìn)而減慢胃腸傳輸速度。Lee JI等[6]對(duì)STC患者乙狀結(jié)腸標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn),各層組織中ICC數(shù)量均減少。林琳等[7]對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的結(jié)腸慢傳輸型小鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)45 d后實(shí)驗(yàn)組小鼠近端結(jié)腸組織陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組顯著減少,60 d后嗎啡組的陽(yáng)性細(xì)胞較納洛酮阻斷組和對(duì)照組顯著減少,提示近端結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的減少可能是結(jié)腸慢傳輸運(yùn)動(dòng)的原因之一。

穴位埋線作為目前臨床治療STC的有效方法之一?，F(xiàn)代研究表明穴位埋線能改善大腸運(yùn)動(dòng)狀態(tài),加速對(duì)糞便的推進(jìn),此作用通過(guò)興奮副交感神經(jīng),同時(shí)抑制交感神經(jīng),增加大腸液分泌,以利于潤(rùn)滑作用;同時(shí)還能糾正胃腸道肌電的紊亂狀況[8],從而調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)。穴位作用的特異性是臨床配穴及取得療效的關(guān)鍵,也是針灸研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。在臨床治療STC中,我們經(jīng)常用到的穴位有天樞、大腸俞、上巨虛,而它們對(duì)大腸功能有著各自的特異性效應(yīng)。天樞乃足陽(yáng)明胃經(jīng)的腹部要穴及大腸經(jīng)氣所聚集之處,為治療便秘的重要穴位[9]。天樞為大腸之募穴,腑氣之所通。天樞又緊鄰脾胃,為氣機(jī)運(yùn)行之樞機(jī)。大腸俞可補(bǔ)大腸津液而潤(rùn)腸通便,常與天樞俞募相配,相得益彰。上巨虛為大腸經(jīng)下合穴,根據(jù)《靈樞·邪氣臟腑病形》“合治內(nèi)府”理論,故上巨虛穴能治療大腸疾病,疏導(dǎo)腸腑而治療便秘,同時(shí)它又位于足陽(yáng)明胃經(jīng)上,可使胃與大腸共調(diào),增強(qiáng)腸蠕動(dòng),使腑氣下行,推動(dòng)腸道內(nèi)糞便下排。因此,本次研究通過(guò)觀察穴位埋線對(duì)STC模型大鼠腸道傳輸功能及其結(jié)腸組織Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響,來(lái)試圖探討穴位埋線治療STC的可能作用機(jī)制及不同穴位調(diào)節(jié)STC的穴位特異性。在研究中我們發(fā)現(xiàn),天樞、上巨虛、大腸俞對(duì)大鼠6 h內(nèi)首粒黑便排出時(shí)間均有改善作用,能顯著縮短排便時(shí)間,且天樞的作用效果更優(yōu)于上巨虛和大腸俞(P＜0.01);天樞、上巨虛、大腸俞對(duì)大鼠6 h內(nèi)大便重量有改善作用,能增加大鼠排便重量。天樞組、上巨虛組及大腸俞組對(duì)碳推進(jìn)百分率均有顯著改善作用,均能使其得到明顯提高(P＜0.01)。但天樞組較大腸俞組在改善程度方面更為明顯。模型組Cajal間質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞,分布不連續(xù),形態(tài)也多異常,提示Cajal間質(zhì)細(xì)胞的病理改變可能是STC的發(fā)病機(jī)制之一。經(jīng)穴位埋線治療后,天樞組、上巨虛組、大腸俞組大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)分布及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)多與正常組接近,且天樞組與上巨虛組、大腸俞組相比,大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增加較明顯(P＜0.01),提示穴位埋線能改善結(jié)腸組織中Cajal間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),以達(dá)到治療目的,且不同穴位調(diào)節(jié)STC存在穴位特異性,特別是天樞更具有明確治療STC的臨床選取應(yīng)用意義。但穴位埋線是通過(guò)何種途徑改善STC結(jié)腸平滑肌結(jié)構(gòu)及Cajal間質(zhì)細(xì)胞的病理改變,還有待我們進(jìn)一步的深入研究。

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