肌鈣蛋白T基因單核苷酸多態(tài)性與運(yùn)動(dòng)性橫紋肌溶解癥的關(guān)聯(lián)研究*

白春宏， 薄 海， 秦永生， 彭 朋△

運(yùn)動(dòng)性橫紋肌溶解癥(exertional rhabdomyolysis，ERM)是由于不習(xí)慣的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)(特別是離心運(yùn)動(dòng))造成肌肉組織崩解、細(xì)胞內(nèi)容物如肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌紅蛋白(myoglobin，Mb)釋放入血循環(huán)、最終引起腎衰竭甚至死亡的綜合征［1］。ERM典型癥狀為黑尿(肌紅蛋白尿)、肌痛、僵硬、無力，并發(fā)癥包括急性腎衰、骨筋膜室綜合征、高鉀血癥和酸中毒等［1］。普通健康人安靜時(shí)出現(xiàn)具有臨床癥狀ERM的發(fā)生率極低，但在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)應(yīng)激時(shí)，不同個(gè)體的反應(yīng)差異很大，特別是合并熱應(yīng)激和脫水時(shí)易出現(xiàn)ERM，其具體機(jī)制未明。有研究證實(shí)，ERM易感性可能與遺傳因素有關(guān)［2］。本研究以武警戰(zhàn)士為研究對(duì)象，利用一次大強(qiáng)度負(fù)重訓(xùn)練造成亞臨床(非臨床癥狀)ERM，分析慢肌型肌鈣蛋白T(slow troponin T，sTnT)基因第7內(nèi)含子C7761T位點(diǎn)與快肌型肌鈣蛋白T(fast troponin T，fTnT)基因第8內(nèi)含子T7955C位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與大強(qiáng)度訓(xùn)練后血清CK含量之間的關(guān)系，探索ERM的可能遺傳機(jī)制。

材料和方法

1 研究對(duì)象

武警某部戰(zhàn)士85名，男性，年齡(23.3±1.9)歲，身高(1.73 ±0.04)m，體重(64.3 ±4.4)kg，體重指數(shù)(body mass index，BMI)(21.4 ± 1.7)kg/m2。排除安靜血清CK(CKrest)超標(biāo)(＞200 IU/L)者和肌炎、肌病、中暑、心血管及代謝性疾病患者。實(shí)驗(yàn)前2天禁止進(jìn)行大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練以及肌肉治療和服用藥物(包括營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑)。

2 亞臨床ERM實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ?］

利用一次大強(qiáng)度負(fù)重訓(xùn)練造成亞臨床ERM，具體方案:受試者用背囊進(jìn)行負(fù)重，背囊重量為自身體重的30%，先進(jìn)行5 min臺(tái)階試驗(yàn)(臺(tái)階高30 cm，登階頻率每分鐘54步，用節(jié)拍器控制節(jié)律)，緊接著在1 min內(nèi)完成15次蹲起，每個(gè)動(dòng)作3 s蹲下(延長(zhǎng)離心收縮時(shí)間)，2 s站起。

3 取血及血清CK測(cè)定

清晨7:00～8:00，受試者空腹?fàn)顟B(tài)下指尖取血20 μL，用酶動(dòng)力學(xué)法測(cè)定CKrest活性(A6半自動(dòng)生化分析儀)，肘靜脈取血3 mL測(cè)定外周血白細(xì)胞sTnT 和 fTnT基因多態(tài)性。實(shí)驗(yàn)后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h 和 120 h 分別取指尖血20 μL測(cè)定血清CK活性的變化規(guī)律，記錄峰值CK(CKpeak)值并計(jì)算 CK最大變化值(ΔCKmax=CKpeak－CKrest)。

4 PCR-RFLP測(cè)定sTnT和fTnT基因多態(tài)性

取100 μL全血，利用 DNA提取試劑盒(Tiangen)提取白細(xì)胞基因組DNA，－80℃低溫冰箱凍存。取基因組DNA 5 μL，PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1。反應(yīng)條件為，預(yù)變性:95℃ 5 min;35個(gè)循環(huán):95℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃30 s;72℃5 min。

sTnT基因擴(kuò)增片段產(chǎn)物長(zhǎng)度為221 bp，經(jīng)Eco47 I內(nèi)切酶消化后，出現(xiàn)3種基因型:有Eco47 I酶切位點(diǎn)的純合型C/C為174 bp和47 bp 2條帶，無Eco47 I酶切位點(diǎn)的純合型T/T為221 bp 1條帶，雜合型C/T為221 bp、174 bp和47 bp 3條帶。fTnT基因擴(kuò)增片段產(chǎn)物長(zhǎng)度為287 bp，經(jīng)TspE I內(nèi)切酶消化后，出現(xiàn)3種基因型:有TspE I酶切位點(diǎn)的純合型T/T為144 bp和143 bp 2條帶，無TspE I酶切位點(diǎn)的純合型C/C為287 bp 1條帶，雜合型T/C為287 bp、143 bp和144 bp 3條帶。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1.Primer design

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件包分析。卡方檢驗(yàn)計(jì)算基因型頻率是否符合哈-溫遺傳平衡定律。按基因型分組后，組間各指標(biāo)比較使用單因素方差分析，多重比較使用LSD-t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 sTnT和fTnT基因的分布頻率與受試者的一般特征

sTnT 3 種基因型(T/T:18.8%;C/T:49.4%;C/C:31.8%)和等位基因(T:43.5%;C:56.5%)，以及fTnT 3 種基因型(T/T:8.2%;T/C:41.2%;C/C:50.6%)和等位基因(T:28.8%;C:71.2%)的分布頻率經(jīng)卡方檢驗(yàn)均為P＞0.05，符合哈-溫遺傳平衡定律，具有群體代表性，見表2。受試者年齡、身高、體重、BMI等特征在各組均無顯著差異(均 P＞0.05)，具有可比性，見表3。

表2 sTnT和fTnT基因型及等位基因的分布頻率Table 2.sTnT and fTnT genotypic and allelic distribution frequency

表3 受試者一般特征Table 3.Baseline characteristics of the subjects(Mean±SD)

2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前后血清CK的時(shí)程變化

血清CKrest為(145±33)IU/L，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后24 h開始逐漸升高，72 h達(dá)峰值［CKpeak:(2 972±1 648)IU/L］，隨后開始逐漸下降，見圖1。

Figure 1.Time course of serum CK activity.Mean ± SD.n=85.＊＊P ＜0.01 vs rest(0 h).圖1 血清CK活性的時(shí)程變化

3 不同基因型間血清CK活性的比較

sTnT基因:C/T基因型組和C/C基因型組CKrest均高于T/T基因型組(均P＜0.01)，CKpeak和ΔCKmax在各組間無顯著差異(均P＞0.05)。由于T/T基因型組只有16人(18.8%)，為避免統(tǒng)計(jì)誤差，將T/T基因型組與C/T基因型組合并為(T/T+C/T)基因型組，即T等位基因組(對(duì)fTnT的基因型進(jìn)行相同的處理)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(T/T+C/T)組 CKrest低于C/C基因型組(P ＜0.05)，見表3。

fTnT基因:T/C基因型組和C/C基因型組CKrest均低于 T/T基因型組(分別為 P＜0.05和 P＜0.01)，C/C基因型組CKpeak和ΔCKmax均低于T/T基因型組和T/C基因型組(均P＜0.01)。T等位基因組(即T/T+T/C組)CKpeak和 ΔCKmax均高于C/C基因型組(均 P ＜0.01)，見表4。

討 論

ERM易發(fā)于士兵和運(yùn)動(dòng)員人群，其最危險(xiǎn)的并發(fā)癥是由于循環(huán)Mb進(jìn)入腎臟造成的急性腎衰竭，特別是在熱環(huán)境和脫水的情況下更容易發(fā)生。通常，反復(fù)的離心運(yùn)動(dòng)會(huì)造成肌細(xì)胞機(jī)械或化學(xué)應(yīng)激損傷［4］，進(jìn)而導(dǎo)致 ERM。CK 是肌肉崩解的標(biāo)志物［5］，但不同個(gè)體對(duì)于大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)(特別是離心運(yùn)動(dòng))的反應(yīng)大相徑庭，有報(bào)道血清CK可達(dá)到38 517 IU/L(正常值40～170 IU/L)。本研究的受試者CKrest均在正常范圍內(nèi)，但大強(qiáng)度訓(xùn)練后，CKpeak為(2 972±1 648)IU/L，237 ～ 7 405 IU/L，ΔCKmax則為 (2 826 ±1 649)IU/L，102 ～7 269 IU/L，即不同受試者對(duì)相同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷存在顯著個(gè)體差異，其具體機(jī)制未明。

表4 不同基因型間血清CK活性的比較Table 4.Comparison of serum CK activity between different genotype groups(IU/L.Mean±SD)

在排除體格、身體素質(zhì)等因素后，越來越多的研究證實(shí)了遺傳基因在ERM發(fā)生中的作用，但關(guān)鍵基因仍未明確。既往研究證實(shí)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-II［6］、肌酸激酶骨骼肌型［3，7］、白細(xì)胞介素 6［8］、腫瘤壞死因子 α［8］、趨化因子配體與受體［9］、α-輔肌動(dòng)蛋白 3［10］、肌球蛋白輕鏈激酶［10］等多個(gè)基因變異與ERM易感性相關(guān)聯(lián)。這些研究分別從肌肉代謝因子(酶)、炎癥反應(yīng)、收縮蛋白等方面探討了相關(guān)基因多態(tài)與肌肉損傷的關(guān)系。本研究以武警戰(zhàn)士為受試對(duì)象并參照文獻(xiàn)［3］建立亞臨床ERM實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?即血清CK升高，但不伴有臨床癥狀)，從肌肉收縮鈣調(diào)控的角度探討sTnT和fTnT基因多態(tài)與ERM的關(guān)系。

ERM發(fā)生的重要機(jī)制是細(xì)胞能量代謝障礙并導(dǎo)致胞漿內(nèi)鈣離子的異常升高，細(xì)胞內(nèi)鈣依賴性蛋白酶及磷脂酶被激活，造成肌原纖維、細(xì)胞骨架及胞膜蛋白破壞［11-12］。丹曲林鈉(骨骼肌松弛劑)可阻滯肌漿網(wǎng)鈣釋放，對(duì)過度運(yùn)動(dòng)性肌損傷具有顯著的保護(hù)作用［13］。骨骼肌收縮時(shí)胞內(nèi)鈣離子調(diào)控蛋白包括肌集鈣蛋白1、蘭尼堿受體1、L型鈣通道以及肌鈣蛋白等［14］。TnT是肌鈣蛋白復(fù)合體(由 TnT、TnI和 TnC構(gòu)成)的一個(gè)亞基。TnT將肌鈣蛋白復(fù)合體維系在細(xì)肌絲上，在骨骼肌細(xì)肌絲的Ca2+調(diào)控系統(tǒng)中處于核心位置。在沒有TnT的情況下，無論是否存在Ca2+，肌肉同樣可以被激活產(chǎn)生收縮。因此，TnT是在靜息電位時(shí)抑制肌肉收縮不可缺少的組分，它可以將TnI和TnC不依賴于Ca2+的活性功能整合為依賴Ca2+的活性功能。人類的TnT有3種同源蛋白:sTnT、fTnT和心肌型TnT(cTnT)，分別在骨骼肌慢肌、快肌和心肌中特異性表達(dá)。研究證實(shí)，血清TnT水平是診斷運(yùn)動(dòng)性損傷的特異標(biāo)志物，TnT相關(guān)基因多態(tài)與運(yùn)動(dòng)能力［15］可能也存在關(guān)聯(lián)。因此我們推測(cè)，sTnT與fTnT基因多態(tài)可能與ERM易感性有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，fTnT基因T/C基因型組和C/C基因型組CKrest均低于T/T基因型組，sTnT基因C/T基因型組和C/C基因型組CKrest則均高于T/T基因型組，T等位基因組CKrest低于C/C基因型組，提示fT-nT基因T/T基因型、sTnT基因C/T和C/C基因型與安靜時(shí)CK高反應(yīng)有關(guān);一次負(fù)重訓(xùn)練后，fTnT基因T等位基因組CKpeak和ΔCKmax均高于C/C基因型組，而sTnT基因CKpeak和ΔCKmax在各基因型組間均無顯著差異，說明fTnT基因T等位基因具有肌肉損傷促進(jìn)作用，可能是ERM易感性的分子遺傳學(xué)標(biāo)記。其機(jī)制在于，劇烈運(yùn)動(dòng)(特別是肌肉離心收縮)時(shí)，主要是快肌纖維參與工作，fTnT在調(diào)節(jié)快肌興奮收縮偶聯(lián)中起重要作用，T等位基因(T/C+T/T)變異改變了相應(yīng)蛋白質(zhì)的功能，造成其對(duì)Ca2+敏感性增強(qiáng)，進(jìn)而影響了肌肉收縮的效率，肌肉損傷和ERM易感性隨之增加。

本研究證明fTnT基因第8內(nèi)含子T7955C位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可作為ERM易感性的分子遺傳學(xué)標(biāo)志，T等位基因攜帶者是患ERM的高危人群。

本研究的結(jié)果提示某些基因型或等位基因具有肌肉損傷保護(hù)或促進(jìn)作用。攜帶fTnT基因第8內(nèi)含子T7955C位點(diǎn)T等位基因的個(gè)體在運(yùn)動(dòng)應(yīng)激后血清CK會(huì)大大升高，是患ERM和急性腎衰竭的高危人群。今后的研究應(yīng)繼續(xù)尋找ERM易感基因，從分子水平揭示CK高反應(yīng)機(jī)制，為軍事訓(xùn)練提供個(gè)性化監(jiān)控指標(biāo)——基因標(biāo)志，同時(shí)對(duì)于篩查易感人群、及早發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)損傷危險(xiǎn)因素和預(yù)防ERM發(fā)生具有重要的理論和實(shí)踐意義。

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