促紅細(xì)胞生成素通過調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)減輕順鉑所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡*

孔德陽， 黃智勇， 唐 杰， 郝建兵

抗腫瘤藥物順鉑(cisplatin，CP)是導(dǎo)致藥物性急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的主要原因之一，其病理生理機(jī)制中以CP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡作用較為明顯。CP誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡作用的靶點(diǎn)獨(dú)立于DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡信號，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)時激活的凋亡信號途徑發(fā)揮作用［1-2］。ERS激活多種信號途徑，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生存，稱為未折疊蛋白反應(yīng) (unfolded protein response，UPR)［3］。在ERS情況下，未折疊蛋白反應(yīng)處于活化狀態(tài)，ERS分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)作為未折疊蛋白反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的中心調(diào)解蛋白在其中可能起關(guān)鍵作用。

重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)自1986年應(yīng)用臨床后，在缺血-再灌注損傷或順鉑誘導(dǎo)的AKI模型中，已被證實(shí)可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生，加速腎臟功能恢復(fù)［4-5］。研究證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞表面、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔表面有EPO受體(erythropoietin receptor，EPOR)表達(dá)，EPO與EPOR結(jié)合后影響細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;其中，EPO對腎小管上皮細(xì)胞、腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)主要通過EPO抗凋亡機(jī)制介導(dǎo)［6］。目前，尚無研究表明rHuEPO對順鉑腎臟毒性的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)ERS時未折疊蛋白反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)中心蛋白GRP78、減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)。為了探討rHuEPO發(fā)揮CP腎毒性保護(hù)作用的分子機(jī)制，鑒別保護(hù)AKI潛在的治療靶點(diǎn)，本研究利用CP誘導(dǎo)的AKI模型進(jìn)行了如下研究。

材料和方法

1 動物

SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，6～8周齡，200～250 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

2 主要試劑

rHuEPO由華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司提供，規(guī)格3 000 U/支，河北石家莊;順鉑，規(guī)格10 mg/支，山東齊魯制藥;TUNEL染色試劑盒 (Dead-EndTMColorimetric TUNEL System;Promega);兔抗EPOR及GRP-78多克隆抗體(Novus Biologicals);小鼠β-actin單克隆抗體(Sigma);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG(碧云天公司)。

3 主要方法

3.1 SD大鼠分組 36只SPF級健康SD雄性大鼠，隨機(jī)分為3組:正常對照組(control組)12只:單純腹腔注射 0.9% 生理鹽水(0.9%saline，5 mL·kg－1);順鉑模型組(CP組)12只:單純腹腔注射順鉑(10 mg·kg－1，0.9% 生理鹽水溶解順鉑 2 g·L－1);順鉑 +rHuEPO組(CP+rHuEPO組)12只:rHuEPO(5 000 U·kg－1)于順鉑注射前48 h，順鉑注射前15 min及順鉑注射后48 h尾靜脈注射給藥。

3.2 腎臟組織標(biāo)本的處理 將3組SD大鼠均CP或0.9%生理鹽水注射后96 h，用2%戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠臺上，腹正中切口3 cm，暴露腹腔，直視下找到雙腎，分別分離腎周圍脂肪囊和腎筋膜后，用動脈夾夾閉腎臟動靜脈，切除整個腎，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的0.9%的冷生理鹽水沖洗后，將一部分腎組織離體后分成小塊迅速放入液氮，一部分應(yīng)用OCT包埋劑包埋后置于液氮中，并置于－80℃冰箱中保存，用Western blotting檢測蛋白質(zhì)表達(dá)及激光共聚焦檢測;一部分腎組織置于10%甲醛溶液中固定48 h，用于病理檢查。

3.3 血清標(biāo)本的留取 SD大鼠處死時采用腹主動脈穿刺取血，每只約5 mL，取血后1 mL裝入血常規(guī)采血管(EDTA抗凝管)，立即送檢;4 mL裝入促凝管，室溫下靜置4 h后，4℃ 3 000 r·min－1離心15 min后分離血清，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 生化分析 檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)水平，采用日立7150型全自動生化分析儀測定。

3.5 腎臟組織病理學(xué)觀察 PAS染色觀察腎臟組織病理改變:將腎組織標(biāo)本用10%福爾馬林溶液固定48 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋;2 μm切片，常規(guī)脫蠟，1%過碘酸氧化，入Schiff氏液，蘇木素染細(xì)胞核后1%鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán);鏡下觀察細(xì)胞核成藍(lán)色，基底膜染成粉紅色;梯度乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片;光鏡下觀察腎臟病理改變。

3.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 腎組織用10%福爾馬林固定過夜，脫水、透明、石蠟包埋，切片厚2 μm，置于包被有多聚賴氨酸的載玻片上。TUNEL染色按試劑盒說明書操作。計數(shù)每個視野中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)。每張切片隨機(jī)取6～8個不重疊視野，每個腎臟觀察2～3張切片。每個腎臟的細(xì)胞凋亡程度以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示。

3.7 免疫印跡法(Western blotting法) RIPA細(xì)胞裂解液預(yù)冷后30～200 μL加入裝有組織的1.5 mL EP管中，超聲破碎儀破碎4～6 s，至組織溶解，冰浴30 min，4 ℃、12 000 r·min－1離心 30 min，取上清(即蛋白)，－80℃保存。(1)BCA法蛋白濃度測定(參照說明書，Pierce);(2)蛋白變性:用2×SDS加樣緩沖液與蛋白樣品等體積混合，蛋白變性，100℃，5 min→冰浴10 min，－20℃保存(獲得均一濃度的蛋白質(zhì))，以備電泳用;(3)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺)凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，將膜去離子水沖洗后，放入封閉袋中加入封閉液，封閉約4 h;(4)加入EPOR和GRP78(1∶500)Ⅰ抗，4℃過夜;(5)顯色;以 β-actin作為內(nèi)參照，用Image J凝膠圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

3.8 免疫熒光分析 采用OCT包埋劑包埋組織塊用于免疫熒光染色。4 μm切片置于多聚賴氨酸防脫片的載玻片;PBS清洗5 min×3次;1%牛血清白蛋白室溫封閉30 min;腎臟組織切片Ⅰ抗(GRP78多克隆抗體，1∶25)4℃孵育過夜;PBS清洗10 min×3;組織切片F(xiàn)ITC偶聯(lián)Ⅱ抗(1∶100)室溫避光孵育1 h;PBS清洗10 min×3次;含DAPI防淬滅劑封片;激光共聚焦顯微鏡觀察，放大倍數(shù)×400。

3.9 免疫組化分析 石蠟包埋腎臟組織2 μm切片，行免疫組化染色，方法如下:二甲苯脫蠟;保濕盒內(nèi)3%H2O2浸30 min，PBS洗滌5 min×2次;將切片浸于枸櫞酸鉀溶液中，微波至微沸騰;室溫放置30 min冷卻后用血清封閉抗原30 min;滴加1∶500稀釋的EPOR抗體，4℃條件下過夜;第2天取出保濕盒，室溫放置30 min，PBS洗滌5min×3次;滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫放置50 min，PBS洗滌5 min×3次;滴加 Vectastain? R.T.U.ABC Reagent，室溫放置30 min，PBS洗滌5 min×3次;光鏡下DAB顯色1～10 min;自來水沖洗，PBS浸5 min;蘇木素染液復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán);乙醇梯度脫水;樹膠封片;高倍鏡下觀察(×400)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 rHuEPO治療可以降低順鉑誘導(dǎo)AKI SD大鼠的BUN和SCr水平并減輕腎小管損傷

1.1 血清腎功能分析結(jié)果 與control組比較，順鉑注射96 h，CP組SCr和 BUN水平明顯升高(P＜0.05)，注射rHuEPO可以顯著減低SD大鼠的SCr水平(P ＜0.05)，見圖1A。

1.2 腎臟病理結(jié)果 順鉑注射96 h，近端腎小管刷狀緣脫落，管型堵塞腎小管，腎小管基底膜裸露。提前注射rHuEPO可減少順鉑注射后96 h腎臟中壞死腎小管數(shù)量，促進(jìn)腎小管修復(fù)，見圖1B。

Figure 1.The levels of SCr and BUN(A)and morphological changes of rat renal tissue(B)in each group(PAS staining，×400).Mean ±SD.n=12.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs CP group.圖1 各組SCr水平、BUN水平及腎臟病理改變

2r HuEPO治療恢復(fù)了EPOR水平

2.1 免疫組化結(jié)果 在順鉑或生理鹽水經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)后96 h，與control組相比，CP組及CP+rHuEPO組EPOR蛋白表達(dá)明顯增加;與CP組相比，CP+rHuEPO組EPOR蛋白表達(dá)明顯減少，見圖2A。

2.2 Western blotting結(jié)果 與control組比較，CP組及CP+rHuEPO組EPOR蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)，差異顯著(P＜0.05)。與CP組比較，CP+rHuEPO組EPOR蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)，差異顯著(P＜0.05)，見圖2B。

Figure 2.The expression of EPOR in each group detected by immunohistochemistry(A，×400)and Western blotting(B).Mean±SD.n=12.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs CP group.圖2 免疫組化法及Western blotting法檢測各組EPOR蛋白表達(dá)

3 rHuEPO治療可以減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡

應(yīng)用TUNLE染色檢測細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核被染成棕褐色為TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。CP組見TUNEL陽性細(xì)胞大部分位于腎臟皮髓交界處的腎小管管壁和管腔內(nèi);control組幾乎未見TUNEL陽性細(xì)胞;CP+rHuEPO組可見少量TUNEL陽性細(xì)胞。經(jīng)腎小管凋亡評分，可見CP組和CP+rHuEPO組凋亡程度顯著高于control組，差異顯著(P＜0.05);CP+rHuEPO組與CP組比較凋亡指數(shù)低于CP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.TUNEL-staining of renal tubular epithelium cell apoptosis in each group(×400).Mean±SD.n=12.*P ＜0.05 vs Control group;#P ＜0.05 vs CP group.圖3 TUNEL檢測各組腎臟小管上皮細(xì)胞凋亡狀況

4 rHuEPO治療減輕了順鉑誘導(dǎo)的AKI SD大鼠腎臟組織的未折疊蛋白反應(yīng)

4.1 激光共聚焦結(jié)果 在CP或生理鹽水經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)后96 h，與control組相比，CP組及rHuEPO組GRP78(RFP標(biāo)記，紅色)蛋白表達(dá)明顯增加;與CP組相比較，GRP78蛋白表達(dá)明顯減少，見圖4A。

4.2 Western blotting結(jié)果 與control組比較，CP組及CP+rHuEPO組GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)，差異顯著(P＜0.05);與CP組比較，CP+rHuEPO組GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異顯著(P＜0.05)，見圖 4B。

Figure 4.rHuEPO attenuated CP-induced UPR in renal tubular epithelium cells.A:the expression level of GRP78 protein detected by immunofluorescence and observed by laser confocal microscopy(×400);B:Western blotting of GRP78.Mean±SD.n=12.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs CP group.圖4 rHuEPO治療減輕了順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)

討 論

本研究證實(shí)在實(shí)驗(yàn)條件下10 mg/kg CP處理SD大鼠96 h后，與正常對照組相比，腎小管上皮細(xì)胞數(shù)減少，壞死細(xì)胞數(shù)增多及腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)增高。與既往報道一致，這提示細(xì)胞凋亡在CP誘導(dǎo)的腎小管上皮小損傷中發(fā)揮著重要作用［7］。由于順鉑在體內(nèi)腎臟的濃度顯著高于肝臟、脾臟等器官，尤其是近端小管S3段，因而能夠引起腎小管中毒性損害而誘導(dǎo)AKI。病理生理學(xué)研究提示順鉑可激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜信號通路，導(dǎo)致小管上皮細(xì)胞損傷和死亡［8］;刺激腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-α介導(dǎo)炎癥損傷［9］;介導(dǎo)腎臟血管損傷，并導(dǎo)致腎臟血流量減少和缺血損傷，使腎小球?yàn)V過率進(jìn)一步下降［10］。其中，以順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡作用較為明顯［11］，因而將抗凋亡作為早期治療靶點(diǎn)，深入研究CP誘導(dǎo)AKI時腎小管上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制是重要研究領(lǐng)域。

rHuEPO是利用基因重組技術(shù)人工合成的促紅細(xì)胞生成素。已有研究報道，rHuEPO能夠改善CP誘導(dǎo)的AKI恢復(fù)。對腎臟的保護(hù)可能通過表達(dá)在人或鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)、乳突及近端小管細(xì)胞系的EPOR發(fā)揮作用。EPOR屬于細(xì)胞因子受體超家族成員，缺乏酪氨酸激酶活性。EPOR在腎臟不同類型的細(xì)胞均有表達(dá)，包括小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。Wen等［12］研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷過程中EPO-EPOR系統(tǒng)具有內(nèi)源性保護(hù)作用，在腦缺血再灌注區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞上調(diào)EPOR和增加分泌EPO，并且EPOR上調(diào)要早于增加分泌EPO。本研究發(fā)現(xiàn)，EPOR在正常SD大鼠的腎臟廣泛表達(dá)，經(jīng)CP處理的大鼠EPOR發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用表達(dá)增加，EPO治療后可以短時期內(nèi)增加血清中EPO水平，rHuEPO與腎臟部位的EPOR結(jié)合，同時，血清中EPO的快速增高可能抑制組織中EPOR及EPO mRNA表達(dá)，使腎臟組織EPOR表達(dá)量下降(圖2)。

最近研究表明，通過ERS誘導(dǎo)的凋亡在缺血再灌注及藥物腎毒性包括抗生素、免疫抑制劑、化療藥物等模型的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用［9］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂能夠引起ERS，導(dǎo)致錯誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蓄積，過度或持續(xù)的ERS將會啟動細(xì)胞的凋亡程序［13］。病理情況下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白折疊受抑制，活化多種信號通路進(jìn)而未折疊蛋白反應(yīng)被活化。GRP78屬于熱休克蛋白家族的成員，是ERS誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的主要調(diào)節(jié)者。未折疊蛋白反應(yīng)可使GRP78大量表達(dá)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，恢復(fù)蛋白質(zhì)構(gòu)象，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，因此，GRP78在應(yīng)激條件下對細(xì)胞起保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果顯示，CP組腎小管上皮細(xì)胞GRP78表達(dá)上調(diào)(圖4)，提示順鉑誘導(dǎo)的腎損傷啟動了未折疊蛋白反應(yīng)，GRP78顯著上調(diào)以發(fā)揮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自身穩(wěn)定功能，盡管如此，腎小管上皮細(xì)胞仍發(fā)生凋亡可能是由于持續(xù)的未折疊蛋白反應(yīng)激活了特異性的CHOP及caspase-12介導(dǎo)的凋亡通路。

許多研究報道EPO參與不同模型促進(jìn)細(xì)胞生存信號，如 JAK/STAT、PKC 及 PI3K/Akt信號通路［14］。研究表明，保護(hù)細(xì)胞免于 ERS引起的凋亡需要PI3K/Akt通路活化;因此，ERS誘導(dǎo)的PI3K/Akt通路的活化是細(xì)胞生存信號［15］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用rHuEPO預(yù)治療CP處理的大鼠，能夠明顯降低CP誘導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)，進(jìn)而減輕CP所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。然而，ERS期間是否有前生存通路Akt的活化，PI3K/Akt通路是否介導(dǎo)了外源性EPO減輕未折疊蛋白反應(yīng)而發(fā)揮了抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步的研究仍然是必要的。

［1］ Kharbanda S，Ren R，Pandey P，et al.Activation of the c-Abl tyrosine kinase in the stress response to DNA-damaging agents［J］.Nature，1995，376(6543):785-788.

［2］ Leibbrandt ME，Wolfgang GH，Metz AL，et al.Critical subcellular targets of cisplatin and related platinum analogs in rat renal proximal tubule cells［J］.Kidney Int，1995，48(3):761-770.

［3］ Prachasilchai W，Sonoda H，Yokota-Ikeda N，et al.A protective role of unfolded protein response in mouse ischemic acute kidney injury［J］.Eur J Pharmacol，2008，592(1-3):138-145.

［4］ Spandou E，Tsouchnikas I，Karkavelas G，et al.Erythropoietin attenuates renal injury in experimental acute renal failure ischaemic/reperfusion model［J］.Nephrol Dial Transplant，2006，21(2):330-336.

［5］ Bagnis C，Beaufils H，Jacquiaud C，et al.Erythropoietin enhances recovery after cisplatin-induced acute renal failure in the rat［J］.Nephrol Dial Transplant，2001，16(5):932-938.

［6］ 黎磊石，劉志紅，謝紅浪，等.中國腎臟病學(xué)［M］.第1版.北京:人民軍醫(yī)出版社，2008:1917-1923.

［7］ Salahudeen AK，Haider N，Jenkins J，et al.Antiapoptotic properties of erythropoiesis-stimulating proteins in models of cisplatin-induced acute kidney injury［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，294(6):F1354-F1365.

［8］ Liu H，Baliga R.Endoplasmic reticulum stress-associated caspase 12 mediates cisplatin-induced LLC-PK1 cell apoptosis［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16(7):1985-1992.

［9］ Ramesh G，Reeves WB.TNF-alpha mediates chemokine and cytokine expression and renal injury in cisplatin nephrotoxicity［J］.J Clin Invest，2002，110(6):835-842.

［10］ Pabla N，Dong Z.Cisplatin nephrotoxicity:mechanisms and renoprotective strategies［J］.Kidney Int，2008，73(9):994-1007.

［11］王 駿，黃先鋒，余學(xué)清.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)減輕順鉑所致的腎小管上皮細(xì)胞損傷［J］.中國病理生理雜志，2008，24(7):1378-1383.

［12］ Wen TC，Rogido M，Genetta T，et al.Permanent focal cerebral ischemia activates erythropoietin receptor in the neonatal rat brain［J］.Neurosci Lett，2004，355(3):165-168.

［13］ Song S，Chew C，Dale BM，et al.A requirement for the p85 PI3K adapter protein BCAP in the protection of macrophages from apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress［J］.J Immunol，2011，187(2):619-625.

［14］ Ma R，Xiong N，Huang C，et al.Erythropoietin protects PC12 cells from β-amyloid25-35-induced apoptosis via PI3K/Akt signaling pathway［J］.Neuropharmacology，2009，56(6-7):1027-1034.

［15］ Mao W，Iwai C，Liu J，et al.Darbepoetin alfa exerts a cardioprotective effect in autoimmune cardiomyopathy via reduction of ER stress and activation of the PI3K/Akt and STAT3 pathways［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，45(2):250-260.