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    促紅細(xì)胞生成素通過調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)減輕順鉑所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡*

    2014-11-08 02:27:46孔德陽黃智勇郝建兵
    中國病理生理雜志 2014年1期
    關(guān)鍵詞:腎小管陽性細(xì)胞切片

    孔德陽, 黃智勇, 唐 杰, 郝建兵

    抗腫瘤藥物順鉑(cisplatin,CP)是導(dǎo)致藥物性急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的主要原因之一,其病理生理機(jī)制中以CP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡作用較為明顯。CP誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡作用的靶點(diǎn)獨(dú)立于DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡信號,通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)時激活的凋亡信號途徑發(fā)揮作用[1-2]。ERS激活多種信號途徑,以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生存,稱為未折疊蛋白反應(yīng) (unfolded protein response,UPR)[3]。在ERS情況下,未折疊蛋白反應(yīng)處于活化狀態(tài),ERS分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)作為未折疊蛋白反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的中心調(diào)解蛋白在其中可能起關(guān)鍵作用。

    重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin,rHuEPO)自1986年應(yīng)用臨床后,在缺血-再灌注損傷或順鉑誘導(dǎo)的AKI模型中,已被證實(shí)可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生,加速腎臟功能恢復(fù)[4-5]。研究證實(shí),腎小管上皮細(xì)胞表面、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔表面有EPO受體(erythropoietin receptor,EPOR)表達(dá),EPO與EPOR結(jié)合后影響細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;其中,EPO對腎小管上皮細(xì)胞、腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)主要通過EPO抗凋亡機(jī)制介導(dǎo)[6]。目前,尚無研究表明rHuEPO對順鉑腎臟毒性的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)ERS時未折疊蛋白反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)中心蛋白GRP78、減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)。為了探討rHuEPO發(fā)揮CP腎毒性保護(hù)作用的分子機(jī)制,鑒別保護(hù)AKI潛在的治療靶點(diǎn),本研究利用CP誘導(dǎo)的AKI模型進(jìn)行了如下研究。

    材料和方法

    1 動物

    SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠,雄性,6~8周齡,200~250 g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

    2 主要試劑

    rHuEPO由華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司提供,規(guī)格3 000 U/支,河北石家莊;順鉑,規(guī)格10 mg/支,山東齊魯制藥;TUNEL染色試劑盒 (Dead-EndTMColorimetric TUNEL System;Promega);兔抗EPOR及GRP-78多克隆抗體(Novus Biologicals);小鼠β-actin單克隆抗體(Sigma);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG(碧云天公司)。

    3 主要方法

    3.1 SD大鼠分組 36只SPF級健康SD雄性大鼠,隨機(jī)分為3組:正常對照組(control組)12只:單純腹腔注射 0.9% 生理鹽水(0.9%saline,5 mL·kg-1);順鉑模型組(CP組)12只:單純腹腔注射順鉑(10 mg·kg-1,0.9% 生理鹽水溶解順鉑 2 g·L-1);順鉑 +rHuEPO組(CP+rHuEPO組)12只:rHuEPO(5 000 U·kg-1)于順鉑注射前48 h,順鉑注射前15 min及順鉑注射后48 h尾靜脈注射給藥。

    3.2 腎臟組織標(biāo)本的處理 將3組SD大鼠均CP或0.9%生理鹽水注射后96 h,用2%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定于鼠臺上,腹正中切口3 cm,暴露腹腔,直視下找到雙腎,分別分離腎周圍脂肪囊和腎筋膜后,用動脈夾夾閉腎臟動靜脈,切除整個腎,放入預(yù)先準(zhǔn)備好的0.9%的冷生理鹽水沖洗后,將一部分腎組織離體后分成小塊迅速放入液氮,一部分應(yīng)用OCT包埋劑包埋后置于液氮中,并置于-80℃冰箱中保存,用Western blotting檢測蛋白質(zhì)表達(dá)及激光共聚焦檢測;一部分腎組織置于10%甲醛溶液中固定48 h,用于病理檢查。

    3.3 血清標(biāo)本的留取 SD大鼠處死時采用腹主動脈穿刺取血,每只約5 mL,取血后1 mL裝入血常規(guī)采血管(EDTA抗凝管),立即送檢;4 mL裝入促凝管,室溫下靜置4 h后,4℃ 3 000 r·min-1離心15 min后分離血清,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    3.4 生化分析 檢測血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,SCr)水平,采用日立7150型全自動生化分析儀測定。

    3.5 腎臟組織病理學(xué)觀察 PAS染色觀察腎臟組織病理改變:將腎組織標(biāo)本用10%福爾馬林溶液固定48 h,常規(guī)脫水、石蠟包埋;2 μm切片,常規(guī)脫蠟,1%過碘酸氧化,入Schiff氏液,蘇木素染細(xì)胞核后1%鹽酸乙醇分化,氨水返藍(lán);鏡下觀察細(xì)胞核成藍(lán)色,基底膜染成粉紅色;梯度乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片;光鏡下觀察腎臟病理改變。

    3.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 腎組織用10%福爾馬林固定過夜,脫水、透明、石蠟包埋,切片厚2 μm,置于包被有多聚賴氨酸的載玻片上。TUNEL染色按試劑盒說明書操作。計數(shù)每個視野中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)。每張切片隨機(jī)取6~8個不重疊視野,每個腎臟觀察2~3張切片。每個腎臟的細(xì)胞凋亡程度以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比表示。

    3.7 免疫印跡法(Western blotting法) RIPA細(xì)胞裂解液預(yù)冷后30~200 μL加入裝有組織的1.5 mL EP管中,超聲破碎儀破碎4~6 s,至組織溶解,冰浴30 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心 30 min,取上清(即蛋白),-80℃保存。(1)BCA法蛋白濃度測定(參照說明書,Pierce);(2)蛋白變性:用2×SDS加樣緩沖液與蛋白樣品等體積混合,蛋白變性,100℃,5 min→冰浴10 min,-20℃保存(獲得均一濃度的蛋白質(zhì)),以備電泳用;(3)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺)凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,麗春紅染色,將膜去離子水沖洗后,放入封閉袋中加入封閉液,封閉約4 h;(4)加入EPOR和GRP78(1∶500)Ⅰ抗,4℃過夜;(5)顯色;以 β-actin作為內(nèi)參照,用Image J凝膠圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

    3.8 免疫熒光分析 采用OCT包埋劑包埋組織塊用于免疫熒光染色。4 μm切片置于多聚賴氨酸防脫片的載玻片;PBS清洗5 min×3次;1%牛血清白蛋白室溫封閉30 min;腎臟組織切片Ⅰ抗(GRP78多克隆抗體,1∶25)4℃孵育過夜;PBS清洗10 min×3;組織切片F(xiàn)ITC偶聯(lián)Ⅱ抗(1∶100)室溫避光孵育1 h;PBS清洗10 min×3次;含DAPI防淬滅劑封片;激光共聚焦顯微鏡觀察,放大倍數(shù)×400。

    3.9 免疫組化分析 石蠟包埋腎臟組織2 μm切片,行免疫組化染色,方法如下:二甲苯脫蠟;保濕盒內(nèi)3%H2O2浸30 min,PBS洗滌5 min×2次;將切片浸于枸櫞酸鉀溶液中,微波至微沸騰;室溫放置30 min冷卻后用血清封閉抗原30 min;滴加1∶500稀釋的EPOR抗體,4℃條件下過夜;第2天取出保濕盒,室溫放置30 min,PBS洗滌5min×3次;滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗,室溫放置50 min,PBS洗滌5 min×3次;滴加 Vectastain? R.T.U.ABC Reagent,室溫放置30 min,PBS洗滌5 min×3次;光鏡下DAB顯色1~10 min;自來水沖洗,PBS浸5 min;蘇木素染液復(fù)染,PBS沖洗返藍(lán);乙醇梯度脫水;樹膠封片;高倍鏡下觀察(×400)。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 rHuEPO治療可以降低順鉑誘導(dǎo)AKI SD大鼠的BUN和SCr水平并減輕腎小管損傷

    1.1 血清腎功能分析結(jié)果 與control組比較,順鉑注射96 h,CP組SCr和 BUN水平明顯升高(P<0.05),注射rHuEPO可以顯著減低SD大鼠的SCr水平(P <0.05),見圖1A。

    1.2 腎臟病理結(jié)果 順鉑注射96 h,近端腎小管刷狀緣脫落,管型堵塞腎小管,腎小管基底膜裸露。提前注射rHuEPO可減少順鉑注射后96 h腎臟中壞死腎小管數(shù)量,促進(jìn)腎小管修復(fù),見圖1B。

    Figure 1.The levels of SCr and BUN(A)and morphological changes of rat renal tissue(B)in each group(PAS staining,×400).Mean ±SD.n=12.*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs CP group.圖1 各組SCr水平、BUN水平及腎臟病理改變

    2r HuEPO治療恢復(fù)了EPOR水平

    2.1 免疫組化結(jié)果 在順鉑或生理鹽水經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)后96 h,與control組相比,CP組及CP+rHuEPO組EPOR蛋白表達(dá)明顯增加;與CP組相比,CP+rHuEPO組EPOR蛋白表達(dá)明顯減少,見圖2A。

    2.2 Western blotting結(jié)果 與control組比較,CP組及CP+rHuEPO組EPOR蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào),差異顯著(P<0.05)。與CP組比較,CP+rHuEPO組EPOR蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào),差異顯著(P<0.05),見圖2B。

    Figure 2.The expression of EPOR in each group detected by immunohistochemistry(A,×400)and Western blotting(B).Mean±SD.n=12.*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs CP group.圖2 免疫組化法及Western blotting法檢測各組EPOR蛋白表達(dá)

    3 rHuEPO治療可以減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡

    應(yīng)用TUNLE染色檢測細(xì)胞凋亡,細(xì)胞核被染成棕褐色為TUNEL陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。CP組見TUNEL陽性細(xì)胞大部分位于腎臟皮髓交界處的腎小管管壁和管腔內(nèi);control組幾乎未見TUNEL陽性細(xì)胞;CP+rHuEPO組可見少量TUNEL陽性細(xì)胞。經(jīng)腎小管凋亡評分,可見CP組和CP+rHuEPO組凋亡程度顯著高于control組,差異顯著(P<0.05);CP+rHuEPO組與CP組比較凋亡指數(shù)低于CP組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    Figure 3.TUNEL-staining of renal tubular epithelium cell apoptosis in each group(×400).Mean±SD.n=12.*P <0.05 vs Control group;#P <0.05 vs CP group.圖3 TUNEL檢測各組腎臟小管上皮細(xì)胞凋亡狀況

    4 rHuEPO治療減輕了順鉑誘導(dǎo)的AKI SD大鼠腎臟組織的未折疊蛋白反應(yīng)

    4.1 激光共聚焦結(jié)果 在CP或生理鹽水經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)后96 h,與control組相比,CP組及rHuEPO組GRP78(RFP標(biāo)記,紅色)蛋白表達(dá)明顯增加;與CP組相比較,GRP78蛋白表達(dá)明顯減少,見圖4A。

    4.2 Western blotting結(jié)果 與control組比較,CP組及CP+rHuEPO組GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào),差異顯著(P<0.05);與CP組比較,CP+rHuEPO組GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯下調(diào),差異顯著(P<0.05),見圖 4B。

    Figure 4.rHuEPO attenuated CP-induced UPR in renal tubular epithelium cells.A:the expression level of GRP78 protein detected by immunofluorescence and observed by laser confocal microscopy(×400);B:Western blotting of GRP78.Mean±SD.n=12.*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs CP group.圖4 rHuEPO治療減輕了順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)

    討 論

    本研究證實(shí)在實(shí)驗(yàn)條件下10 mg/kg CP處理SD大鼠96 h后,與正常對照組相比,腎小管上皮細(xì)胞數(shù)減少,壞死細(xì)胞數(shù)增多及腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)增高。與既往報道一致,這提示細(xì)胞凋亡在CP誘導(dǎo)的腎小管上皮小損傷中發(fā)揮著重要作用[7]。由于順鉑在體內(nèi)腎臟的濃度顯著高于肝臟、脾臟等器官,尤其是近端小管S3段,因而能夠引起腎小管中毒性損害而誘導(dǎo)AKI。病理生理學(xué)研究提示順鉑可激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜信號通路,導(dǎo)致小管上皮細(xì)胞損傷和死亡[8];刺激腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-α介導(dǎo)炎癥損傷[9];介導(dǎo)腎臟血管損傷,并導(dǎo)致腎臟血流量減少和缺血損傷,使腎小球?yàn)V過率進(jìn)一步下降[10]。其中,以順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡作用較為明顯[11],因而將抗凋亡作為早期治療靶點(diǎn),深入研究CP誘導(dǎo)AKI時腎小管上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制是重要研究領(lǐng)域。

    rHuEPO是利用基因重組技術(shù)人工合成的促紅細(xì)胞生成素。已有研究報道,rHuEPO能夠改善CP誘導(dǎo)的AKI恢復(fù)。對腎臟的保護(hù)可能通過表達(dá)在人或鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)、乳突及近端小管細(xì)胞系的EPOR發(fā)揮作用。EPOR屬于細(xì)胞因子受體超家族成員,缺乏酪氨酸激酶活性。EPOR在腎臟不同類型的細(xì)胞均有表達(dá),包括小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。Wen等[12]研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷過程中EPO-EPOR系統(tǒng)具有內(nèi)源性保護(hù)作用,在腦缺血再灌注區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞上調(diào)EPOR和增加分泌EPO,并且EPOR上調(diào)要早于增加分泌EPO。本研究發(fā)現(xiàn),EPOR在正常SD大鼠的腎臟廣泛表達(dá),經(jīng)CP處理的大鼠EPOR發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用表達(dá)增加,EPO治療后可以短時期內(nèi)增加血清中EPO水平,rHuEPO與腎臟部位的EPOR結(jié)合,同時,血清中EPO的快速增高可能抑制組織中EPOR及EPO mRNA表達(dá),使腎臟組織EPOR表達(dá)量下降(圖2)。

    最近研究表明,通過ERS誘導(dǎo)的凋亡在缺血再灌注及藥物腎毒性包括抗生素、免疫抑制劑、化療藥物等模型的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂能夠引起ERS,導(dǎo)致錯誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蓄積,過度或持續(xù)的ERS將會啟動細(xì)胞的凋亡程序[13]。病理情況下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白折疊受抑制,活化多種信號通路進(jìn)而未折疊蛋白反應(yīng)被活化。GRP78屬于熱休克蛋白家族的成員,是ERS誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的主要調(diào)節(jié)者。未折疊蛋白反應(yīng)可使GRP78大量表達(dá),并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合,恢復(fù)蛋白質(zhì)構(gòu)象,穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境,因此,GRP78在應(yīng)激條件下對細(xì)胞起保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果顯示,CP組腎小管上皮細(xì)胞GRP78表達(dá)上調(diào)(圖4),提示順鉑誘導(dǎo)的腎損傷啟動了未折疊蛋白反應(yīng),GRP78顯著上調(diào)以發(fā)揮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自身穩(wěn)定功能,盡管如此,腎小管上皮細(xì)胞仍發(fā)生凋亡可能是由于持續(xù)的未折疊蛋白反應(yīng)激活了特異性的CHOP及caspase-12介導(dǎo)的凋亡通路。

    許多研究報道EPO參與不同模型促進(jìn)細(xì)胞生存信號,如 JAK/STAT、PKC 及 PI3K/Akt信號通路[14]。研究表明,保護(hù)細(xì)胞免于 ERS引起的凋亡需要PI3K/Akt通路活化;因此,ERS誘導(dǎo)的PI3K/Akt通路的活化是細(xì)胞生存信號[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用rHuEPO預(yù)治療CP處理的大鼠,能夠明顯降低CP誘導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng),進(jìn)而減輕CP所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。然而,ERS期間是否有前生存通路Akt的活化,PI3K/Akt通路是否介導(dǎo)了外源性EPO減輕未折疊蛋白反應(yīng)而發(fā)揮了抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用,進(jìn)一步的研究仍然是必要的。

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