硫化氫對糖尿病大鼠ED的影響和機制研究*

毛玉山， 葉小磊， 麥一峰， 王少敏， 洪中立， 王黎明， 趙廷啟， 王鐵樵， 呂 迪， 何文明

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是指陰莖不能達到和(或)維持足夠的勃起以完成滿意的性交，且病程至少持續(xù)6個月以上。據(jù)估計目前全世界約有1億5千萬男性受此困擾。ED作為糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要并發(fā)癥在中國糖尿病患者中的發(fā)生率高達35% ～75%，比非糖尿病患者高3倍多，并隨年齡和病程的增長而明顯增加，癥狀也比一般患者要嚴重［1］。糖尿病患者易伴發(fā)ED的主要原因是體內(nèi)高血糖致血管內(nèi)皮功能受損。由于受損的內(nèi)皮細胞無法產(chǎn)生足夠血管舒張因子一氧化氮(nitric oxide，NO)，進而影響陰莖血管舒張和勃起［2］。除NO之外，另一種新型氣體信號分子硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)正日益受到人們的關注。作為NO和一氧化碳(carbon oxide，CO)之后被發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子，H2S在心血管、神經(jīng)、消化、呼吸、內(nèi)分泌、血液、免疫和泌尿系統(tǒng)中發(fā)揮廣泛生物學效應，并通過多種方式影響多個器官、組織的生理功能［3］。生理濃度的H2S可以直接或者協(xié)同NO舒張血管。內(nèi)源性H2S以L-半胱氨酸(L-cysteine，LCys)為底物通過胱硫醚β-合酶(caystathionine β-synthase，CBS)和(或)胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine γlyase，CSE)的催化而來［3］。有研究顯示，家兔陰莖海綿體組織中不僅可以合成內(nèi)源性的H2S，而且在離體組織中加入硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)后可以松弛陰莖海綿體，進一步研究還發(fā)現(xiàn)，L-Cys/H2S途徑直接調(diào)節(jié)人陰莖海綿體平滑肌松弛過程［4］。本研究采用糖尿病性ED大鼠模型，探索H2S對糖尿病大鼠勃起功能的作用，同時觀察其對CSE活性和表達水平的影響。

材料和方法

1 材料及試劑

NaHS和阿樸嗎啡(apomorphine，APO)均購自Sigma;鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自 Alexis;CSE抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。其余試劑均為分析純或者分子生物級別，購自阿拉丁公司或國藥集團化學試劑有限公司。

2 動物模型的建立及給藥方案

SD雄性大鼠70只，8周齡，體重200～220 g。進入實驗前，經(jīng)與發(fā)情雌鼠交配實驗證實具有正常的性功能。置于12 h光照/黑暗交替環(huán)境中，并給予自由飲水和攝食。適應性飼養(yǎng)1周后，隨機留取10只作為正常組，剩余大鼠禁食8 h，用0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.5)，在冰浴中配制20 g/L STZ，注意避光，即配即用，按文獻中劑量［5］，以 40 mg/kg對大鼠進行腹腔內(nèi)注射。觀察注射STZ后大鼠癥狀，第4天采集大鼠尾靜脈血檢測血糖，任意時間血糖值＞16.7 mmol/L為成功建模。剔除未發(fā)生糖尿病大鼠，對建模成功的糖尿病大鼠進行勃起功能試驗(功能檢測同方法3.1中描述)，篩選存在ED的糖尿病大鼠。將糖尿病合并ED的大鼠隨機均分為DM組、DM+NaHS組和DM+sildenafil組。正常組和DM組每天腹腔注射0.25 mL無菌注射用水;DM+NaHS組參考文獻劑量，按每天50 μmol/kg劑量給予NaHS［6］，腹腔注射0.25 mL NaHS溶液;DM+sildenafil組大鼠參考文獻劑量［7］，按每天5 mg/kg劑量給予灌胃。自由飲食，每天觀察大鼠陰莖勃起情況。整個實驗持續(xù)12周。

3 方法

3.1 陰莖勃起功能試驗 參照文獻描述［8］，將成功建模的大鼠分別標記并稱重，然后放入自制透明的觀察箱(50 cm×30 cm×30 cm，亞克力材質(zhì))中，適應周圍環(huán)境10 min，室內(nèi)保持安靜，光線調(diào)暗，僅夠觀察。每只大鼠按100 μg/kg劑量，在頸項背部皮下注射APO(溶解于含0.2 g/L維生素C的生理鹽水中，調(diào)整體積為5 mL/kg)，注射后使用攝像機從觀察箱底部進行拍攝觀察30 min，記錄陰莖有無勃起、勃起次數(shù)和有無打哈欠等情況。以龜頭充血及末端陰莖體出現(xiàn)為陰莖勃起1次。未見勃起者為糖尿病性ED大鼠。

3.2 血液中H2S濃度檢測 12周實驗結束時，空腹抽取3組大鼠的動脈全血3 mL，置于含肝素的抗凝試管中，離心(4 000 r/min)20 min，取上清血漿1.5 mL存于-80℃留用。取75 μL血漿加入250 μL體積濃度1%的醋酸鋅溶液，隨后加入250 μL 10%三氯乙酸沉淀并終止反應，隨后依次加入N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽(133 μL，20 mmol/L，溶解在 7.2 mol/L 的鹽酸中)和氯化鐵(133 μL，30 mmol/L，溶解在1.2 mol/L鹽酸中)溶液，5 min后吸取300 μL上清于670 nm處酶標儀測值。并設立H2S不同濃度(3.125～200 μmol/L)的標準曲線，以計算和比較不同組間H2S濃度水平。

3.3 陰莖組織中CSE活性檢測 12周實驗結束時，脫頸椎處死大鼠，立刻割取陰莖，于體視鏡下小心剝離皮膚、尿道、筋膜和白膜等。取各組中50 mg大鼠的陰莖海綿體，加入0.5 mL 50 mmol/L預冷的磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)于冰浴中制備組織勻漿，離心后取上清4 μL用于BCA蛋白定量后，取50 μL上清液加入H2S反應液(pH 7.4的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液、10 mmol/L L-半胱氨酸和2 mmol/L磷酸吡哆醛)，移至反應瓶，反應瓶中央的吸收孔中加入1%醋酸鋅0.5 mL，并以濾紙浸入其中以加大吸收面積。反應瓶在封口前用氮氣吹20 s，將反應瓶置于37℃水浴中孵育90 min，加入50%三氯乙酸0.5 mL，37℃孵育60 min終止反應，反應瓶中央孔的液體加入水3.5 mL、20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽0.5 mL和30 mmol/L氯化鐵0.4 mL，室溫靜置20 min后于670 nm讀取吸光度值。

3.4 陰莖組織中CSE mRNA表達檢測 參照文獻［9］方法，割取各組大鼠陰莖海綿體，取一部分采用Trizol一步法提取組織總RNA，剩余用于免疫印跡。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及Oligo(dT)15 primer室溫下逆轉(zhuǎn)錄15 min，然后在42℃下1 h逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。PCR 反應體積25 μL:cDNA 1 μL，CSE 上、下游引物各 1 μL(10 pmol/引物)，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，含 15 mmol/L MgCl2的 PCR 緩沖液 2.5 μL，Taq DNA聚合酶1.25 U。反應條件:95℃變性5 min，94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，熱循環(huán)30 次，72 ℃ 10 min，16℃保溫。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶染色后，用凝膠成像及定量掃描儀測得不同大小條帶。取2 μL PCR產(chǎn)物，以β-肌動蛋白(β-actin)作內(nèi)參照進行PCR，30個熱循環(huán)后，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像及定量掃描儀定量。重復3次獨立實驗。引物序列如下:CSE(NM_017074)PCR產(chǎn)物大小579 bp，上游引物5’-CGC ACA AAT TGT CCA CAA AC-3’，下游引物5’-GCT CTG TCC TTC TCA GGC AC-3’;β-actin(NM_031144)PCR產(chǎn)物大小453 bp，上游引物5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG ACA-3’，下游引物 5’-ACA TCT GCT GGA AGG TGG ACA-3’。

3.5 陰莖組織中CSE蛋白表達檢測 蛋白表達使用免疫印跡法。剩余陰莖海綿體使用冷PBS淋洗2遍，盡量去除血污，切取少量后稱重，按每200 mg組織1mLRIPA裂解液的比例加入，冰上電動勻漿器勻漿組織，12 000×g、4℃離心3 min后收集上清后，使用BCA試劑盒進行蛋白定量，然后在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳。蛋白分離后經(jīng)恒流1.5 h電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，使用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h，與CSE特異性抗體4℃孵育過夜后，次日加入羊抗兔Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發(fā)光液，暗室中壓片顯影。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間差異比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 糖尿病動物模型的建立

糖尿病建模的60只大鼠，其中有49只于第4天檢測血糖值＞16.7 mmol/L，說明建模成功，DM建模成功率81.7%。DM大鼠表現(xiàn)出明顯多飲、多食、多尿、消瘦以及毛皮無光澤等典型癥狀。經(jīng)過阿撲嗎啡勃起功能測試，36只DM大鼠存在ED，發(fā)生率為73.5%。將這群DM合并ED大鼠隨機分為3組:DM組、DM+NaHS組和DM+sildenafil組，每組12只。整個實驗期間，正常組無大鼠死亡;DM組有2只大鼠死于第6周，1只死于第10周;DM+NaHS組有1只大鼠死于第9周;DM+sildenafil組有1只大鼠死于第4周。死亡大鼠在統(tǒng)計時剔除。12周實驗結束時，正常組空腹血糖(4.71±0.86)mmol/L，所有DM組(18.56±2.13)mmol/L，差異顯著(P＜0.05)。

2 陰莖勃起功能和血液中H2S含量測定

各組大鼠皮下注射APO后均有毛發(fā)豎立、打哈欠等表現(xiàn)。造模組和正常組大鼠陰莖勃起次數(shù)均有顯著差異(P＜0.05)。糖尿病模型組中大鼠的陰莖平均勃起率為26.5%，有73.5%的DM大鼠存在ED，因此選擇這部分大鼠進行分組后進一步研究。于給藥處理12周后，檢測不同組注射APO后勃起情況見表1。結果顯示，與DM組比，給予NaHS或sildenafil組的勃起功能顯著改善(P＜0.05)，但是勃起率與正常組大鼠比，其勃起功能沒有完全恢復。DM+NaHS組的勃起率不及 DM+sildenafil組(P＜0.05)。

于12周實驗結束時測定各組大鼠血液中H2S的含量，發(fā)現(xiàn)DM+NaHS組、DM+sildenafil組、正常組和DM組大鼠血漿中H2S濃度依次降低，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠注射APO后陰莖勃起情況和12周時血漿中H2S水平比較Table 1.Erectile function after injection of APO and H2S level in rat plasma 12 weeks after treatment in different groups(Mean±SD)

3 陰莖組織中CSE活性及CSE表達水平的檢測

與正常組相比，各DM組CSE活性、mRNA和蛋白表達水平均有降低，其中DM+NaHS組的CSE水平最低，與正常組比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1和表2。

Figure 1.The mRMA(A)and protein(B)expression of CSE in rat corpus cavernosum with different treatments.圖1 不同處理組大鼠陰莖海綿體組織中CSE mRNA和CSE蛋白的表達

表2 各組大鼠海綿體組織中CSE活性及CSE mRNA和蛋白表達水平Table 2.The activity and mRNA and protein expression levels of CSE in rat corpus cavernosum(Mean±SD)

討 論

DM動物模型是研究DM病理、病理生理及其并發(fā)癥治療的重要動物模型。其建模方式有多種，而腹腔注射STZ具有成本低、操作簡單、成功率高、死亡率低等特點，成為最常用的建模方法。直接特異性殺傷胰島β細胞是STZ誘發(fā)DM的主要機制［5］。本研究中DM組中出現(xiàn)大鼠死亡，可能與血糖過高，導致酮癥酸中毒、脫水乃至昏迷有關。DM高血糖狀態(tài)時，陰莖血管內(nèi)皮細胞受損、海綿體平滑肌發(fā)生異常、松弛機制受損，直接影響到勃起早期的血液動力學改變，使得ED在DM患者中發(fā)生率更高。目前治療ED的藥物以5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑為主，代表藥物如西地那非、伐地那非等，其作用機制是阻斷PDE5，減少cGMP在細胞內(nèi)的降解，導致NO-cGMP通路持續(xù)激活，使得NO的舒血管活性持續(xù)發(fā)揮;然而在臨床應用過程中，約35%患者對PDE5抑制劑無效，尤其是那些合并有DM或者其它心血管疾病的患者［10］，其主要原因可能與血管內(nèi)皮嚴重受損致使NO分泌絕對不足密切相關。在NO-cGMP通路無法被有效激活狀態(tài)下，后續(xù)使用抑制cGMP降解的藥物自然也無濟于事。而針對H2S的研究，可能有望為克服PDE5抑制劑的局限性提供新思路。

H2S最早為人們所認識，是一種具有特殊臭味的氣體，是大氣的主要污染物。直至上世紀80年代，研究人員發(fā)現(xiàn)H2S也是體內(nèi)一種內(nèi)源性物質(zhì)，其分子量小、結構簡單、擴散迅速，且可以自由通過細胞膜，在體內(nèi)扮演著信號分子角色，調(diào)節(jié)人體多種生理機能。在CSE-/-小鼠中容易發(fā)生年齡依賴性高血壓，這一結果類似缺失NOS的轉(zhuǎn)基因小鼠模型;而且在CSE-/-小鼠中構建心肌缺血再灌注模型后，使用PDE5抑制劑后無法顯示出較為明顯的心血管保護作用［11］。以上研究結果說明CSE功能受損導致H2S釋放減少，無法通過提高NO利用率解決，提示H2S與NO共同參與血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持和調(diào)節(jié)。

外源性H2S可通過體外給予NaHS轉(zhuǎn)化，NaHS在體內(nèi)分解出HS-，然后HS-與體內(nèi)的H+結合，即生成H2S。同NO一樣，H2S也有較強的血管舒張作用，被認為是一種有效的鉀離子通道開放劑，還可通過NF-κB通路等途徑發(fā)揮心血管保護作用［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，外源性H2S對陰莖海綿體也具有血管舒張和促進勃起的功能。其中一項研究顯示［6］，在靈長類動物陰莖內(nèi)注射20 μmol/kg NaHS后，可以同時增進陰莖的長度和海綿竇內(nèi)的壓力;進一步研究還發(fā)現(xiàn)，海綿體也具有合成內(nèi)源性H2S的能力，并不依賴于血管內(nèi)皮細胞而松弛平滑肌。這些研究結果表明，H2S對陰莖勃起功能有著重要調(diào)節(jié)作用，尤其是當血管內(nèi)皮受損致NO途徑失活后，有望成為治療ED的另一個作用途徑，其機制將迥然于PDE5類抑制劑。

本研究首先成功建立了DM大鼠模型，建模成功率達到81.7%。觀察正常組、DM組和DM+NaHS組大鼠在注射了APO后的陰莖勃起情況，發(fā)現(xiàn)DM大鼠ED發(fā)生率超過70%，而進行了NaHS干預的大鼠ED率明顯下降。同時，大鼠血液中H2S含量的檢測結果也表明，DM組大鼠血液中H2S最低，正常組其次，DM+NaHS組由于給予了外源性的H2S供體NaHS，其水平也最高，說明H2S與陰莖勃起功能具有相關性，但是在勃起改善方面效果不如西地那非組。為了進一步研究H2S對動物勃起功能的影響，結合H2S在體內(nèi)的生成機制，進行CSE活性及CSE mRNA和蛋白表達水平的檢測。結果顯示，正常組的CSE活性和CSE mRNA以及蛋白表達水平最高，而DM+NaHS組的水平最低，可能是大量外源性H2S進入體內(nèi)，顯著提高了體內(nèi)H2S含量，進而反饋性抑制CSE的表達，從而對內(nèi)源性H2S的生成途徑起到抑制作用，即外源性的H2S對體內(nèi)CSE活性呈負反饋調(diào)節(jié)作用，與國外的研究相符［13-14］。

本研究顯示外源性補充H2S對于糖尿病ED大鼠的勃起功能具有一定治療效果，NaHS治療組的陰莖勃起率顯著高于生理鹽水對照組，但與西地那非治療組相比，其改善勃起效果遠不如后者，表明H2S補充劑NaHS在臨床上取代PDE5抑制劑成為ED治療一線用藥的理論基礎不強。但可否將兩者合用以提高彼此療效，可能是一個值得深入研究的方向。

總之，本實驗結果證實了H2S對糖尿病ED大鼠勃起功能具有顯著改善作用，且其作用機制與體內(nèi)H2S生成機制CSE體系相關。盡管DM+NaHS組大鼠的ED發(fā)生率顯著低于DM組，但與正常組仍有較大差距，說明NaHS治療對大鼠陰莖勃起功能有一定保護作用，但尚不能根本解決。另外，有關外源性H2S補充劑的用藥劑量、用藥周期等方面還需進一步研究，可能為后續(xù)DM患者難治性ED的臨床治療提供新的思路和防治途徑。

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