嗎啡成癮大鼠邊緣下區(qū)腦電活動的無線遙測及分析*

李 晶， 朱再滿， 白家明， 潘群皖△， 李 敏， 虞 冉

阿片類藥物成癮是一種以強迫性用藥、覓藥為核心癥狀的慢性、復發(fā)性腦?。?］。近年來，有研究顯示［2］，內側前額皮層(medial prefrontal cortex，mPFC)參與阿片成癮的形成和復吸過程，其作用機制與mPFC的學習記憶功能密切相關。邊緣下區(qū)(infralimbic cortex，IL)位于 mPFC 的腹側［3-4］，是條件性恐懼和藥物成癮記憶消退的重要腦區(qū)。有關IL區(qū)如何參與阿片成癮的形成過程，IL區(qū)腦電活動的改變對成癮過程有何影響目前尚不清楚。本實驗通過制備嗎啡成癮大鼠條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)模型，在 CPP箱內視頻監(jiān)控大鼠CPP行為的改變，同時利用無線遙測腦電系統(tǒng)實時觀察大鼠IL區(qū)腦電活動的相應變化，以期從神經電生理學視角探索IL區(qū)在大鼠嗎啡成癮過程中的作用及其腦電活動改變對嗎啡成癮過程的影響，為阿片成癮和復吸治療另辟新徑。這種針對阿片成癮大鼠CPP行為變化過程中IL區(qū)腦電活動的實時記錄與分析，迄今少見報道。

材料和方法

1 動物、主要藥品及儀器

1.1 動物 選用成年雄性SD大鼠［合格證號為SCXK(蘇)2009-0001］24只，SPF級，體重290～320 g，購自蘇州愛爾麥特科技有限公司。自由進食、飲水，12 h光照，室溫控制22～25℃。將大鼠隨機分成2組(嗎啡戒斷組和生理鹽水對照組)。

1.2 主要藥品 鹽酸嗎啡注射液(皮下注射)，沈陽第一制藥公司，批號為110508-2，由安徽省醫(yī)藥股份有限公司提供。

1.3 儀器裝置 大鼠腦立體定位儀(第二軍醫(yī)大學);CPP視頻分析裝置(上海吉量軟件科技有限公司);生理無線遙測腦電系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

2 方法

2.1 腦立體定位埋植電極手術 以1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠，將其俯臥位(使門齒桿低于耳間連線3 mm，調整前囟與后囟至同一水平面)固定在腦立體定位儀上。剪毛、消毒，切開頭皮，剝離骨膜，暴露骨縫，參照大鼠腦立體定位圖譜［5］定位左側IL區(qū)(前囟前3.2 mm，中縫向左旁開0.6 mm，硬膜下5.2 mm)，定位點鉆孔。記錄電極使用直徑0.3 mm的漆包鎳鉻絲，尖端裸露2 mm，植入定位孔硬膜下5.2 mm，同時放置參考電極于頭皮下，采用自凝牙托粉封固。術后恢復7 d，連續(xù)5 d給予青霉素(400 kU·kg－1)抗感染，每天1次。

2.2 嗎啡成癮大鼠CPP模型的制備 模型制備前期，對大鼠進行CPP行為預測試。打開CPP裝置的通道隔板，使大鼠在兩箱中自由活動15 min，每日1次，共3 d，比較大鼠在兩箱中各自平均停留時間，同時采用CPP視頻系統(tǒng)分析軟件繪制大鼠活動軌跡圖。比較結果表明，大鼠均偏愛黑箱，因此模型制備階段，設非天然偏愛箱(白箱)為伴藥箱。模型制備期，用隔板關閉黑、白箱間通道。戒斷組大鼠每日皮下注射嗎啡及生理鹽水(NS)各1次［6］，注射嗎啡后投入白箱45 min，注射NS后投入黑箱45 min，2次注射間隔8 h，CPP訓練共8 d，嗎啡首日劑量10 mg·kg－1，以后逐日遞增 10 mg·kg－1，至 6 d 達到 60 mg·kg－1，7～8 d維持該劑量，對照組大鼠以相同方法注射NS。模型制備結束后打開通道，于戒斷期1～3 d，通過CPP視頻系統(tǒng)對大鼠的CPP行為進行測試，計測其15 min內在白箱中停留時間，同時繪制大鼠活動軌跡圖。經組間比較及組內給藥前后對照，明確大鼠CPP的形成。

2.3 大鼠IL區(qū)腦電的遙測及分析 記錄方法參照文獻［7］，于造模前及戒斷期，在CPP裝置的視頻箱內，使用無線遙測腦電系統(tǒng)實時計測各組大鼠在不同行為狀態(tài)下左側IL區(qū)的腦電活動。行為狀態(tài)類型包括:白箱停留、黑箱停留、白－黑箱穿梭及黑－白箱穿梭。利用無線遙測腦電系統(tǒng)的快速傅里葉變換(fast Fourier transform，F(xiàn)FT)功能處理分析原始腦電，原始腦電圖的橫坐標表示腦電信號的采樣時點，縱坐標表示腦電波幅。高通及低通濾波分別為0.1 Hz和 100 Hz，采樣率 500 Hz。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用獨立樣本t檢驗及重復測量的方差分析。若方差不齊時，采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 嗎啡成癮大鼠CPP模型檢測

如圖1和表1所示，注射8 d嗎啡的戒斷組大鼠，戒斷1～3 d在白箱中停留時間明顯長于同階段注射NS的對照組大鼠(P＜0.01)。與造模前白箱停留時間相比，造模后對照組大鼠在白箱中停留時間無顯著變化(P＞0.05);戒斷組大鼠戒斷1～3 d在白箱中停留時間均顯著延長(P＜0.01)，并且戒斷組大鼠在白箱中停留時間隨戒斷天數(shù)增加逐漸延長，戒斷3 d在白箱中停留時間最長，表明戒斷3 d位置偏愛最明顯。上述結果提示，戒斷1～3 d戒斷組大鼠對白箱產生穩(wěn)定的CPP，模型檢測驗證制模成功。

Figure 1.The maps of activity tracks of the rats in withdrawal group before and after modeling.A:before modeling;B:withdrawal 1 d;C:withdrawal 2 d;D:withdrawal 3 d.圖1 戒斷組大鼠造模前后活動軌跡圖

2 大鼠在黑、白箱中停留或經黑、白箱間穿梭時，IL區(qū)遙測腦電的變化

造模前，戒斷組大鼠在黑、白箱中停留或經黑、白箱間穿梭時IL區(qū)遙測腦電與對照組大鼠同一行為狀態(tài)下的IL區(qū)腦電無明顯差異(P＞0.05)。

造模后戒斷3 d，戒斷組與對照組大鼠相比，IL區(qū)遙測腦電表現(xiàn)為:當戒斷組大鼠停留于白箱時，δ波明顯減少(P＜0.05)，β波(以β2波增加為主)明顯增加(P＜0.01)，θ波及α波組間比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖2;當戒斷組大鼠停留于黑箱時，IL區(qū)腦電各波與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖3;當戒斷組大鼠由黑箱向白箱穿梭時，IL區(qū)腦電δ波顯著增加(P＜0.01)，α波(包括α1波和α2波)顯著減少(P＜0.01)，β波(包括 β1波和β2波)顯著減少(P＜0.01)，僅θ波組間差異不顯著(P＞0.05)，見圖4;當戒斷組大鼠由白箱向黑箱穿梭時，IL區(qū)腦電各波與對照組相比無明顯改變(P＞0.05)，見圖 5。

表1 大鼠在白箱中停留時間比較Table 1.Comparison of the spending time of the rats in the white box(s.Mean ±SD.n=12)

Figure 2.The telemetry electrical activity of left IL when rats stayed in white box on withdrawal 3 d.Mean±SD.n=12.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖2 戒斷3 d大鼠停留于白箱時左側IL遙測腦電活動

Figure 3.The telemetry electrical activity of left IL when rats stayed in black box on withdrawal 3 d.Mean±SD.n=12.圖3 戒斷3 d大鼠停留于黑箱時左側IL遙測腦電活動

討 論

Figure 4.The telemetry electrical activity of left IL when rats shuttled from black box to white box on withdrawal 3 d.Mean± SD.n=12.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control group.圖4 戒斷3 d大鼠黑－白箱穿梭時左側IL遙測腦電活動

Figure 5.The telemetry electrical activity of left IL when rats shuttled from white box to black box on withdrawal 3 d.Mean±SD.n=12.圖5 戒斷3 d大鼠白－黑箱穿梭時左側IL遙測腦電活動

阿片類藥物成癮者具有強烈的心理渴求(覓藥動機)，在藥物耐受、依賴和強迫戒斷后，一旦藥物相關環(huán)境線索暴露，覓藥動機引燃，即可產生復吸。相關研究顯示，在阿片成癮的形成中，用藥行為由最初的可控性過渡到強迫性用藥，該過程與mPFC的功能異常密切相關，mPFC是中腦腹側背蓋區(qū)多巴胺神經元的主要投射區(qū)，參與藥物成癮相關的學習、記憶過程［8］。在mPFC中，位于腹側的IL區(qū)是調控藥物成癮的重要腦區(qū)之一，主要行使認知、行為決策、情緒表達調節(jié)等功能［9］。因此本實驗將IL區(qū)作為研究焦點，探討嗎啡成癮大鼠CPP表現(xiàn)最強烈時期(戒斷3 d)IL區(qū)腦電的變化，這項實驗將為阿片成癮及復吸機制的深入研究提供參考。

在IL區(qū)參與阿片成癮形成機制的長期探索中，部分研究認為IL區(qū)具有覓藥抑制功能，如IL區(qū)注射 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid，AMPA)和β2腎上腺素能受體激動劑可抑制大鼠海洛因覓藥行為恢復［9］，選擇性失活IL區(qū)神經元則增加海洛因誘導的大鼠CPP恢復［10］;進一步研究表明IL區(qū)也具有促進覓藥功能，如Bossert等［11］報道IL區(qū)至伏隔核殼部的谷氨酸能投射纖維激活引發(fā)線索誘導的大鼠海洛因覓藥復燃，注射γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid，GABA)受體激動劑至IL區(qū)使其失活，可消退復燃現(xiàn)象。從上述文獻分析提示IL區(qū)神經元的功能或許具有雙重性:即一部分IL區(qū)神經元抑制覓藥;而另一部分IL區(qū)神經元促進覓藥。IL區(qū)的這種雙重性體現(xiàn)在本實驗中:(1)戒斷3 d，當嗎啡成癮大鼠(與對照組相比)由黑箱向白箱穿梭時，IL區(qū)腦電活動出現(xiàn)一過性δ波明顯增加，α波(α1、α2)及 β 波(β1、β2)明顯減少，結果提示 IL 區(qū)神經元功能受到短時壓抑。IL區(qū)是控制沖動行為的重要腦區(qū)［12］，阿片類藥物的長期使用可損害IL區(qū)的結構和功能，使藥物成癮者對沖動行為控制能力下降。對嗎啡戒斷大鼠前額聯(lián)絡皮層的腦電分析研究顯示［13］，嗎啡攝入可引起前額皮層部分神經元功能受到抑制、興奮性降低，引起該區(qū)腦電慢波增加。考慮本實驗中受抑制的部分IL區(qū)神經元，可能參與對大鼠覓藥行為的抑制性調控(IL抑制區(qū))，當其功能受到壓抑時，對大鼠覓藥沖動的控制力削弱，則大鼠向白箱穿梭覓藥行為表達增強。(2)當嗎啡成癮大鼠進入白箱并停留時，IL區(qū)腦電呈現(xiàn)δ波顯著減少，β波(主要是β2)顯著增加。有研究發(fā)現(xiàn)［14-15］，藥物相關環(huán)境線索暴露可激活中腦腹側背蓋區(qū)→杏仁核→IL區(qū)的投射通路，通過IL區(qū)激活的部分神經元集群進一步編碼和調控阿片獎賞效應與藥物相關環(huán)境線索聯(lián)合的學習過程。在本實驗中，嗎啡成癮大鼠停留于白箱(伴藥箱)時，藥物相關環(huán)境線索的充分暴露可能激活了具有促進覓藥功能的IL區(qū)神經元，使其腦電呈現(xiàn)慢波(δ波)減少，快波(β波)增加的趨勢。(3)當嗎啡成癮大鼠由白箱向黑箱穿梭或停留于黑箱時，IL區(qū)腦電各波與對照組比較無顯著差異。表明在上述行為狀態(tài)下，嗎啡成癮大鼠IL區(qū)腦電活動未發(fā)生特異性改變;黑箱(非伴藥箱)作為非藥物相關環(huán)境線索，在IL區(qū)腦電活動的改變過程中未產生顯著影響。

綜合上述實驗結果分析，嗎啡成癮大鼠穿梭覓藥與停留于藥物相關環(huán)境線索中引發(fā)的IL區(qū)腦電活動改變可能存在不同機制;IL區(qū)神經元功能在大鼠嗎啡成癮過程中或許起雙重調控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在給予大鼠嗎啡注射8 d后，具有抑制覓藥功能的IL區(qū)神經元出現(xiàn)功能障礙，不能有效遏制覓藥動機及其行為;具有促進覓藥功能的IL區(qū)神經元在嗎啡作用下出現(xiàn)激活，可增強動物覓藥渴求。伴隨不同神經元功能的改變，IL區(qū)相應部位產生特征性的生物電變化，例如嗎啡成癮大鼠由黑箱向白箱穿梭時，抑制覓藥功能的IL區(qū)神經元表現(xiàn)興奮性降低，促進覓藥功能的IL區(qū)神經元少量激活，綜合腦電活動改變?yōu)槁ɑ顒釉龆?當嗎啡成癮大鼠進入白箱并停留時，少量激活的IL區(qū)促進覓藥功能的神經元在充分場景暴露下進一步激活，這種神經元的興奮引起的腦電快波掩蓋了IL區(qū)抑制覓藥功能神經元的慢波活動，因此成癮大鼠白箱停留腦電表現(xiàn)為快波增多。

［1］ 薛麗芬，薛言學，何 佳，等.下邊緣皮質中神經元周圍基質網絡(PNNs)的降解聯(lián)合消退訓練能夠抑制嗎啡獎賞記憶的復燃［J］.中國藥物依賴性雜志，2012，21(2):105-110.

［2］ 郝 悅，楊靜玉，吳春福.內側前額葉皮層損毀對小鼠位置偏愛及學習記憶的影響［J］.中國藥理通訊，2004，21(3):7-8.

［3］ 王益琦，劉惠芬.覓藥行為消退的研究進展［J］.中國藥物依賴性雜志，2011，20(5):334-339.

［4］ 李培培，張麗麗，韋 美，等.條件性恐懼大鼠邊緣下區(qū)Cdk5激酶活性、caspase-3表達以及突觸結構的變化［J］.心理學報，2011，43(5):544-552.

［5］ Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.6th ed.San Diego:Academic Press，2007:50-58.

［6］ 顧珊智，李生斌.各種實驗因素對建立大鼠嗎啡依賴模型的影響［J］.西安交通大學學報(醫(yī)學版)，2004，25(5):446-448.

［7］ 潘群皖，黃 磊，朱再滿，等.海洛因誘導的條件性位置偏愛大鼠額葉聯(lián)絡皮層腦電的無線遙測及其分析［J］.中國病理生理雜志，2012，28(9):1589-1596.

［8］ 楊 燁，張春燕，王 斌，等.嗎啡成癮及戒斷大鼠前額葉皮質蛋白質組變化的初步研究［J］.中國應用生理學雜志，2011，27(2):184-186.

［9］ 王益琦，陳俊豐，莊丁丁，等.邊緣下皮層在海洛因覓藥行為消退和恢復中的作用［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2012，26(3):449.

［10］ Ovari J，Leri F.Inactivation of the ventromedial prefrontal cortex mimics re-emergence of heroin seeking caused by heroin reconditioning［J］.Neurosci Lett，2008，444(1):52-55.

［11］ Bossert JM，Stern AL，Theberge FR，et al.Role of projections from ventral medial prefrontal cortex to nucleus accumbens shell in context-induced reinstatement of heroin seeking［J］.J Neurosci，2012，32(14):4982-4991.

［12］曾 紅，郭斯萍.易感人格的工作記憶特征對藥物成癮的調節(jié)機制［J］.心理科學進展，2011，19(3):420-426.

［13］李 晶，潘群皖，朱再滿.嗎啡依賴大鼠戒斷期額葉聯(lián)絡皮層腦電活動的分析［J］.中國藥物依賴性雜志，2012，21(4):273-277.

［14］Kalivas PW，Volkow ND.The neural basis of addiction:a pathology of motivation and choice［J］.Am J Psychiatry，2005，162(8):1403-1413.

［15］ Bossert JM，Stern AL，Theberge FR，et al.Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin［J］.Nat Neurosci，2011，14(4):420-422.