星星草PtGAPDH基因的克隆與表達(dá)分析

張旸，郭海俊，劉龍飚，王卅，梁穎，聶玉哲，李玉花*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國(guó)石油天然氣管道工程有限公司天津設(shè)計(jì)院，天津 300457)

星星草(Puccinelliatenuiflora)俗稱堿茅，屬多年生旱中生鹽生草本植物，廣泛分布在我國(guó)北方和世界大部分地區(qū)，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐旱、耐寒、耐鹽堿等特性，是一種較好的改良鹽堿化土壤的先鋒植物[1]。該植物的根系發(fā)達(dá)，具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力，在生理上通過滲透調(diào)節(jié)作用減輕鹽堿對(duì)細(xì)胞膜的損害，利用有限的水分散失獲取最大的CO2同化量，降低氣孔導(dǎo)度、延緩蒸騰作用以適應(yīng)鹽堿脅迫下吸水困難的特性[2]。在分子水平上，通過構(gòu)建星星草cDNA文庫(kù)及芯片雜交的方法，已獲得部分與耐鹽堿特性相關(guān)的高豐度表達(dá)基因[3]，包括離子和水分轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞代謝和防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面。

目前在星星草抗鹽堿特性分子機(jī)制的研究中，已經(jīng)獲得采用NaHCO3脅迫的模擬鹽堿環(huán)境中的星星草基因表達(dá)譜，并通過差異顯示技術(shù)獲得了多個(gè)差異表達(dá)的基因片段[4]。

在從星星草中分離出的相關(guān)抗鹽堿基因中，如HKT2[5]，GAPDH等基因都是其中重要的基因之一，而GAPDH編碼的蛋白(GAPDH)是高等植物糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，是維持生命活動(dòng)能量形成的基本酶類之一[6]，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后控制，作用于核tRNA運(yùn)輸、DNA復(fù)制與修復(fù)等過程，以及調(diào)控組蛋白基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)端粒結(jié)構(gòu)等[7-8]。此外， GAPDH通過抑制活性氧積累[9]、激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]等途徑及多種修飾作用[11-12]參與多種生理過程，具有抵抗逆境脅迫的功能。然而，關(guān)于GAPDH參與植物逆境脅迫響應(yīng)的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

本研究以星星草為試材，采用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends， RACE)的方法克隆星星草GAPDH基因，并對(duì)其在鹽堿脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，為在分子水平上研究星星草的耐鹽堿機(jī)制、深入了解星星草GAPDH基因的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

星星草種子來源于2008年5月份返堿期在黑龍江省青岡縣(東經(jīng)126°06″，北緯46°41″)天然鹽堿地(pH 9.5)草場(chǎng)，采摘后于2010年種于溫室，栽培基質(zhì)采用草炭土∶珍珠巖∶蛭石=3∶2∶1，溫度25℃，光照強(qiáng)度為400 μmol/(m2·s)，相對(duì)濕度65%～75%，生長(zhǎng)到8周齡時(shí)用0，50，100，150和200 mmol/L Na2CO3分別處理24 h后取其地上部分，每組同時(shí)取3次樣，用于實(shí)驗(yàn)重復(fù)，然后用液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诖嘶A(chǔ)上，采用200 mmol/L Na2CO3分別處理0，2，6，12，24，48和72 h，將草的葉片和根部剪下，每組同時(shí)取3次樣用于實(shí)驗(yàn)重復(fù)，用液氮速凍，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取與RACE庫(kù)構(gòu)建

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的方法提取星星草地上部總RNA，滅菌去離子水溶解RNA，利用NanoDrop1000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品的OD260和 OD280比值及濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。利用mRNA Purification Kit(購(gòu)自Amersham Biosciences公司)對(duì)星星草RNA進(jìn)行純化，然后利用MarathonTMcDNA Amplification Kit (購(gòu)自BD Biosciences公司)構(gòu)建星星草RACE cDNA庫(kù)，最后利用RACE cDNA庫(kù)進(jìn)行基因克隆。

星星草GAPDH基因克隆及Northern 雜交探針引物通過PrimerPrimer 5軟件設(shè)計(jì)，并由上海生物工程有限公司進(jìn)行合成。引物序列見表1。

1.3 星星草GAPDH基因克隆及序列測(cè)定

表1 星星草GAPDH基因同源克隆及表達(dá)分析所用引物Table 1 List of primers used for cloning and expression analysis of GAPDH from P. tenuiflora

對(duì)星星草GAPDH基因3′序列的克隆，根據(jù)星星草抑制性消減雜交文庫(kù)中GAPDH基因的EST序列(GeneBank登錄號(hào)GW405820)，設(shè)計(jì)2條3′RACE上游引物GSP3′1和GSP3′2，然后以RACE cDNA庫(kù)為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)引物采用GSP3′1及AP1，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 2 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。第二輪PCR反應(yīng)引物采用GSP3′2及AP2，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 2 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。

對(duì)于星星草GAPDH基因5′序列的克隆，根據(jù)星星草GAPDH基因片段，設(shè)計(jì)2條5′RACE上游引物GSP5′1和GSP5′2。然后以RACE cDNA庫(kù)為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)引物采用GSP5′1及AP1，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 2 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。第二輪PCR反應(yīng)引物采用GSP5′2及AP2，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。

對(duì)于克隆得到星星草GAPDH3′和5′的基因片段測(cè)序并拼接，并在NCBI網(wǎng)站上利用ORF(open reading frame finder)預(yù)測(cè)氨基酸序列，并根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計(jì)特異引物GAPDH-LF和 GAPDH-LR擴(kuò)增GAPDH基因的編碼區(qū)。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。

將所有PCR產(chǎn)物利用天根公司的膠回收試劑盒對(duì)電泳后產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，并與天根公司的pBS-T TA載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到TaKaRa公司Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，提取重組質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過PCR鑒定后送北京六合華大基因進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

為了明確所克隆基因在生物信息學(xué)中的進(jìn)化地位，將所得序列與EMBL/DDBJ/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行BLAST 檢索比對(duì)，獲得與所克隆序列高度相似的同源基因序列，使用ClustalX1.83軟件進(jìn)行堿基序列比對(duì)，使用GeneDoc軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析及保守域的信息標(biāo)注；使用NCBI提供的ORF-finder與保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)(conserved domain database，CDD)分別進(jìn)行基因開放閱讀框分析與蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，并將克隆所得堿基序列按照標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼子的翻譯方式轉(zhuǎn)換為氨基酸序列。使用ExPASY軟件計(jì)算蛋白的理論分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)等參數(shù)；使用ProtScale預(yù)測(cè)和分析蛋白質(zhì)的疏水性/親水性。利用SignalP 3.0(或4.0)Server 程序預(yù)測(cè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。用MEGA 4軟件的鄰位相連法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹。參數(shù)設(shè)定1000個(gè)抽樣重復(fù)進(jìn)行Bootstrap驗(yàn)證，泊松校驗(yàn)(Poisson Correction)作為計(jì)算距離的方法。

1.5 星星草PtGAPDH基因的表達(dá)分析

利用CTAB試劑提取經(jīng)不同濃度Na2CO3(0，50，100，150，200 mmol/L)處理及不同處理時(shí)間(0，2，6，12，24，48，72 h)的星星草地上部及根部樣品總RNA；分別取10 μg總RNA樣品進(jìn)行1.0%的甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，65℃預(yù)雜交1 h，使用地高辛標(biāo)記的GAPDH特異探針(探針引物GAPDH-NF及NR，探針長(zhǎng)度300 bp)雜交1 h，顯影，通過Northern雜交檢測(cè)GAPDH基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 星星草GAPDH基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆及序列比對(duì)

根據(jù)星星草GAPDH基因的EST序列，設(shè)計(jì)GAPDH基因的3′端和5′端基因特異引物，利用構(gòu)建的星星草RACE cDNA庫(kù)，分別克隆得到基因3′端(241 bp)和5′端(953 bp)，經(jīng)過拼接得到1300 bp全長(zhǎng)基因序列(圖1)。去除該基因的3′端非編碼區(qū)和5′端非編碼區(qū)，該基因CDS長(zhǎng)為1014 bp，包含1個(gè)編碼337個(gè)氨基酸的開放閱讀框。將此基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn和Blastp比對(duì)分析，該基因與大麥(Hordeumvulgare)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)等植物的GAPDH基因具有極高的相似性，因而將該基因片段命名為PtGAPDH，GenBank登錄號(hào)為JX411954。該基因編碼蛋白的預(yù)測(cè)分子量為36.5 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.40，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為41，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為39，不穩(wěn)定系數(shù)為23.17，屬于穩(wěn)定蛋白；親水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)值為-0.068，說明此蛋白屬于親水蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明，PtGAPDH基因編碼的蛋白無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，為非分泌性蛋白(non-secretory protein)。

圖1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)Fig.1 The PCR amplification results of PtGAPDHM：DL2000標(biāo)記； A：3′ PCR產(chǎn)物；B：5′ PCR產(chǎn)物；C：CDS產(chǎn)物。M：DL2000 marker；A：3′ PCR product；B：5′ PCR product；C：CDS product.

利用NCBI的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)(CDD)對(duì)PtGAPDH蛋白進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，PtGAPDH基因編碼的蛋白具有2個(gè)保守區(qū)，分別是Gp_dh_ N末端(Gp_dh_N superfamily) 和Gd_ph_C末端超家族 (Gd_ph_C superfamily)。結(jié)合已有報(bào)道，如毛竹(Phyllostachyspubescens)GAPDH蛋白[12]為糖酵解和糖異生的關(guān)鍵酶，也具有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：其中保守區(qū)的C端為Gd_ph_C α螺旋和反平行β折疊的混合結(jié)構(gòu)，是行使糖運(yùn)輸和糖代謝的催化功能域；另一個(gè)保守區(qū)是Gd_ph_N，為NAD+結(jié)合功能域(圖2)，由此類比表明PtGAPDH蛋白具有高度的保守性。

PtGAPDH與其他近緣物種GAPDH蛋白質(zhì)的多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，星星草PtGAPDH基因編碼的氨基酸序列與其他近源物種的GAPDH蛋白均具有較高的相似性，相似度約在87%～97%之間，其中與禾本科植物高羊茅(Festucaarundinacea)、大麥、小麥、水稻的相似性最高，分別為97%，96%，95%和91%，顯示了GAPDH基因在物種進(jìn)化過程中的保守性；MEME-Motif分析表明在PtGAPDH蛋白的第135～142個(gè)氨基酸位置以及第314～322個(gè)氨基酸位置分別含有2個(gè)保守的基序結(jié)構(gòu)，推測(cè)其與GAPDH作為甘油醛-3-磷酸脫氫酶在糖酵解中行使的功能相關(guān)(圖3)。

2.2 PtGAPDH與其他近緣物種的GAPDH基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

為了確定PtGAPDH基因的系統(tǒng)發(fā)生位置，從EMBL/DDBJ/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取16個(gè)近源物種的GAPDH基因的序列信息來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。圖4顯示了系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建的結(jié)果，星星草PtGAPDH基因編碼蛋白與單子葉植物的GAPDH為同一起源，并與高羊茅的同源性最高，在進(jìn)化上屬于同一類分支。

圖2 PtGAPDH基因編碼蛋白的氨基酸保守區(qū)Fig.2 The conserved domain of PtGAPDH Gp_dh_N superfamily: 甘油醛3-磷酸脫氫酶，N端結(jié)構(gòu)域。Gp_dh_C superfamily: 甘油醛3-磷酸脫氫酶，C端結(jié)構(gòu)域。PLN02358: 甘油醛3-磷酸脫氫酶。

圖3 不同植物來源的GAPDH氨基酸序列多重比對(duì)Fig.3 Comparison of the amino acid sequences of GAPDH in different plants

續(xù)圖3 不同植物來源的GAPDH氨基酸序列多重比對(duì)Continue Fig.3 Comparison of the amino acid sequences of GAPDH in different plants PtGAPDH (GeneBank登錄號(hào)Accession number, JX411954)：星星草Puccinellia tenuiflora; TmGAPDH (GeneBank登錄號(hào)Accession number, AY857765)：一粒小麥Triticum monococcum; ZmGAPDH (GeneBank登錄號(hào)Accession number, EU963991)：玉米Zea mays; SiGAPDH (GeneBank登錄號(hào)Accession number, XM_004972916)：小米Setaria italica; LtGAPDH (GeneBank登錄號(hào)Accession number, EU328533)：毒麥Lolium temulentum; FaGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, GQ480772)：高羊茅Festuca arundinacea; HvAK359500(GeneBank登錄號(hào)Accession number, AK359500)：大麥芽Hordeum vulgare; OsGAPDH (GeneBank登錄號(hào)Accession number, GQ848049)：水稻Oryza sativa; TaGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, FN429985)：小麥Triticum aestivum; HvGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, X60343)：大麥芽Hordeum vulgare; BdGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, XM_003573276)：二穗短柄草Brochypodium distachyon; PsGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, DQ922680)：西伯利亞蓼Polygonum sibiricum; AlGAPDH (GeneBank登錄號(hào)Accession number, JN604531)：獐草Aeluropus lagopoides; PpGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, AB826123)：沙梨Pyurs pyrifolia.

2.3 鹽堿脅迫下PtGAPDH基因的表達(dá)分析

為了檢測(cè)星星草PtGAPDH基因與鹽堿逆境的應(yīng)答關(guān)系，利用Na2CO3溶液模擬鹽堿脅迫，對(duì)星星草PtGAPDH基因的表達(dá)特性進(jìn)行Northern雜交檢測(cè)。采用不同濃度的Na2CO3溶液對(duì)星星草植株進(jìn)行處理，圖5所示的Northern雜交結(jié)果表明，50～200 mmol/L Na2CO3溶液處理24 h后植株地上部PtGAPDH基因的表達(dá)量均比對(duì)照組未處理的植株樣品有不同程度的增加，且200 mmol/L Na2CO3處理后表達(dá)量處于較高的穩(wěn)定水平。

選擇200 mmol/L Na2CO3溶液對(duì)星星草進(jìn)行處理，并進(jìn)行時(shí)間梯度的表達(dá)分析。圖6和圖7所示的結(jié)果表明，植株地上部及根部PtGAPDH對(duì)Na2CO3處理后的脅迫均具響應(yīng)。在星星草的葉片中，PtGAPDH基因在無鹽堿處理的樣品(0 h)中幾乎沒有表達(dá)，在鹽堿處理2和6 h后表達(dá)量增加；但在處理12 h時(shí)，表達(dá)量又有所下降；當(dāng)處理24 h時(shí)表達(dá)量又上升且達(dá)到最高，在處理48及72 h后表達(dá)量又回落，呈逐漸下降趨勢(shì)。在根部中，PtGAPDH基因在無鹽堿脅迫處理時(shí)幾乎不表達(dá)，在2 h后開始出現(xiàn)表達(dá)豐度，且表達(dá)量緩慢升高，在24 h后表達(dá)量達(dá)到最大值，但在48及72 h后表達(dá)量又有所回落，呈逐漸下降趨勢(shì)。表明一定濃度的鹽堿脅迫誘導(dǎo)PtGAPDH基因的高豐度表達(dá)，但是當(dāng)脅迫程度(包括脅迫時(shí)間和濃度)超過可承受范圍后，星星草樣品的生理生化機(jī)制發(fā)生變化，PtGAPDH基因的表達(dá)、應(yīng)答通路受到干擾，導(dǎo)致其表達(dá)量回落到低水平。

圖4 PtGAPDH進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenic analysis of PtGAPDH in various plant species PtGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, JX411954)：星星草Puccinellia tenuiflora; AtGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, NP-17280)：擬南芥Arabidopsis thaliana; AcGAPDH (GeneBank登錄號(hào)Accession number, ADQ43814)：菠蘿Ananas comosus; StGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, ABB72804)：馬鈴薯Solanum tuberosum; PpGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, EMJ23673)：碧桃Prunus persica; MtGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, XP-003601828)：蒺藜苜蓿Medicago truncatula; OsGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, NP-001053139)：水稻Oryza sativa; TaGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, ABQ81648)：小麥Triticum aestivum; HvGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, BAJ90709)：大麥Hordeum vulgare; SlGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, XP-004239181)：番茄Solanum lycopersicum; FaGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, ACV86034)：高羊茅Festuca arundinacea; AmGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, CAA42103)：金魚草Antirrhium majus; LcGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, AEO72143)：荔枝Litchi chinensis; VvGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, XP_002263145)：葡萄Vitis vinifera; ThGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, BAJ33926)：鹽芥Thellungiella halophila; SdGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, AEO45785)：野甘草Scoparia dulcis; ZmGAPDH(GeneBank登錄號(hào)Accession number, ADZ55283)：玉米Zea mays.

圖5 不同濃度Na2CO3處理后PtGAPDH基因的表達(dá)Fig.5 PtGAPDH expression after different Na2CO3 concentration stress

圖6 200 mmol/L Na2CO3處理不同時(shí)間后星星草葉片PtGAPDH基因的表達(dá)Fig.6 PtGAPDH expression after time gradient stress with 200 mmol/L Na2CO3 in leaf

3 討論

圖7 200 mmol/L Na2CO3處理不同時(shí)間后星星草根部PtGAPDH基因的表達(dá)Fig.7 PtGAPDH expression after time gradient stress with 200 mmol/L Na2CO3 in root

在植物的抗鹽生理研究中，先前多以NaCl為研究對(duì)象。然而在自然界的鹽害脅迫中，除了NaCl外，以Na2CO3為主的堿性鹽也對(duì)植物產(chǎn)生重要影響。鹽、堿2種脅迫機(jī)理有著明顯的不同，但較NaCl產(chǎn)生的鹽脅迫而言，Na2CO3帶來的堿脅迫由于其能夠提高土壤的pH值，因而具有更大的生態(tài)破壞力。本研究以Na2CO3脅迫下的星星草為研究對(duì)象，對(duì)挖掘該植物的抗逆潛力，揭示其抗性特點(diǎn)，討論其耐鹽堿機(jī)理具有重要意義。研究表明星星草對(duì)鹽脅迫的耐受強(qiáng)度要高于堿脅迫[13]。處理結(jié)束時(shí)，NaCl脅迫的最高存活濃度為600 mmol/L，而Na2CO3的處理濃度超過200 mmol/L時(shí)即導(dǎo)致死亡。并且NaCl對(duì)植株產(chǎn)生的影響比較緩慢，而Na2CO3在處理濃度大于100 mmol/L后脅迫效應(yīng)會(huì)明顯加劇，使植物體的生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)生明顯變化，植物體內(nèi)的一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸等的積累量大幅升高[14]， 細(xì)胞內(nèi)Na+含量較NaCl處理的植物體有顯著提高。而且與羊草(Leymuschinensis)具有相似的生長(zhǎng)適應(yīng)策略及Na+、K+代謝響應(yīng)[15]。尹尚軍等[16]研究指出，星星草的各種脅變指標(biāo)的最大變化多發(fā)生在Na2CO3濃度為150 mmol/L時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明星星草在Na2CO3脅迫條件下的致死濃度為200 mmol/L，因此在研究不同濃度鹽堿脅迫對(duì)星星草抗逆基因表達(dá)的影響中設(shè)計(jì)5個(gè)特定濃度，即：0，50，100，150和200 mmol/L。此外，本研究中選取8周齡的星星草作為試材的原因是因?yàn)樾切遣莸牟蔟g一般在4個(gè)月左右，而8周齡正好是該草的生理成熟期，在該時(shí)間段上基因的表達(dá)和一些生理指標(biāo)呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)，受外界環(huán)境的影響較小。而太老或太嫩的植株會(huì)在各種數(shù)據(jù)上產(chǎn)生波動(dòng)，不宜揭示植物耐鹽堿特性。

植物在經(jīng)受鹽堿脅迫的過程中，隨著鹽堿濃度的增加，細(xì)胞膜的透性增強(qiáng)，對(duì)離子的選擇性吸收減弱，從而使細(xì)胞內(nèi)積累大量Na+，保證細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡。同時(shí)，鹽堿脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)一些代謝副產(chǎn)物的累積，如活性氧。Baek 等[17]將GAPDH基因轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中， 發(fā)現(xiàn)該基因能強(qiáng)烈抑制熱脅迫時(shí)H2O2的產(chǎn)生和細(xì)胞的死亡。而PtGAPDH就是該抗氧化系統(tǒng)中的重要酶類。隨著對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)許多植物GAPDH基因可被多種環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)，說明GAPDH基因的表達(dá)可能增強(qiáng)了植物抵抗這些脅迫的能力。崔麗蓉等[18]對(duì)小麥進(jìn)行脅迫處理后發(fā)現(xiàn)GAPDH基因被誘導(dǎo)，表達(dá)量迅速增加，進(jìn)而強(qiáng)化其抵御環(huán)境變化的脅迫。于麗麗等[19]利用PEG、NaCl及CdCl2處理誘導(dǎo)檉柳(Tamarix)，發(fā)現(xiàn)ThGAPDH基因在根中的表達(dá)上升，但抑制其在莖和葉中的表達(dá)，而NaHCO3處理均能誘導(dǎo)該基因在根、莖、葉中的表達(dá)。在本項(xiàng)研究中，鹽堿脅迫處理會(huì)導(dǎo)致PtGAPDH基因的高量表達(dá)。同時(shí)從各部分雜交結(jié)果體現(xiàn)的趨勢(shì)來看，對(duì)于星星草的葉片和根部，該基因在表達(dá)量上存在差異。

對(duì)星星草在不同濃度的鹽堿脅迫下的PtGAPDH基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在Na2CO3脅迫的致死濃度范圍內(nèi)，不同濃度的Na2CO3脅迫對(duì)基因的表達(dá)并沒有太大影響，說明不同程度的脅迫都會(huì)引起該基因的表達(dá)，但在表達(dá)量上卻沒有太大的差異。雖然在對(duì)關(guān)于不同濃度鹽堿脅迫處理的Northern雜交試驗(yàn)中不能得到PtGAPDH基因表達(dá)量上的線性變化規(guī)律，但從Na2CO3在處理濃度大于100 mmol/L后脅迫效應(yīng)會(huì)明顯加劇這一現(xiàn)象中可以推測(cè)，不同濃度鹽堿脅迫對(duì)星星草生理指標(biāo)的脅迫作用要強(qiáng)于基因表達(dá)方面對(duì)其的影響。因此展開星星草不同濃度鹽堿脅迫下生理指標(biāo)的研究是進(jìn)一步探討抗逆植物耐鹽堿機(jī)制的良好途徑。

PtGAPDH基因在沒有鹽堿脅迫條件下，無論是葉片還是根部均幾乎不表達(dá)。葉片在6和24 h鹽堿脅迫處理后表達(dá)量達(dá)到最大值，其余的處理時(shí)間段上該基因都呈現(xiàn)弱的表達(dá)狀態(tài)。而根部在24 h處理后達(dá)到高峰，在48 h處理后表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，表明該基因在24 h左右對(duì)脅迫的響應(yīng)最大，而且在植物不同的部位，基因雖一直持續(xù)對(duì)脅迫做出響應(yīng)，但對(duì)脅迫的響應(yīng)程度是有差異的。這可能是由于植株不同組織部位的滲透調(diào)節(jié)作用不同，含水量以及無機(jī)離子和有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累量也不同，所以葉片和根部在對(duì)脅迫的響應(yīng)上可能存在時(shí)間和空間上的差異?？鼓婊虻谋磉_(dá)量在鹽堿脅迫下的規(guī)律性變化可以反應(yīng)抗逆植株在抵御逆境脅迫過程中基因的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步深入地探討植物耐鹽堿機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。