CyclinD1和k-ras在宮頸癌中的表達(dá)及意義

劉惠琴 張志杰

(包頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，014040)

CyclinD1和k-ras在宮頸癌中的表達(dá)及意義

劉惠琴 張志杰

(包頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，014040)

目的 通過檢測CyclinD1和k-ras在宮頸癌組織(實(shí)驗(yàn)組)，正常宮頸組織(對(duì)照組)，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ中表達(dá)水平的差異，探討它們?cè)趯m頸癌疾病發(fā)生發(fā)展中所起的作用和可能的分子機(jī)制，為宮頸癌的病因?qū)W研究提供理論依據(jù)。方法 采用免疫組織化學(xué)方法檢測宮頸癌患者15例，正常宮頸組織20例，CINⅠ 18例，CINⅡ 12例，CINⅢ 20例中CyclinD1和k-ras的表達(dá)情況，分析CyclinD1和k-ras在宮頸癌疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的相互關(guān)系。結(jié)果 CyclinD1和k-ras與正常組織比較，在宮頸癌組織中表達(dá)明顯增高，隨著臨床分期的增加，蛋白表達(dá)增強(qiáng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；k-ras蛋白、CyclinD1蛋白與年齡、宮頸癌組織分型中其表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而在分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；且在低分化組為66.7%和59.3%，在高、中分化組為23.7%和28.9%；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為54.8%和63.0%，且CyclinD1和k-ras表達(dá)明顯呈正相關(guān)。結(jié)論 ①k-ras、CyclinD1蛋白的高表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，各種蛋白共同發(fā)揮了協(xié)同作用。②在宮頸癌疾病中CyclinD1和k-ras的表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，且二者表達(dá)明顯相關(guān)。

CyclinD1；k-ras；宮頸癌

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，全世界每年約有50萬婦女患病，僅次于乳腺癌，是引起女性癌癥死亡的重要疾病之一，近年來宮頸癌的發(fā)病率有年輕化的趨勢，因此婦科腫瘤的準(zhǔn)確診斷和預(yù)后的判斷是一個(gè)急需解決的問題[1]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移的過程非常復(fù)雜，多種基因的調(diào)控參與了整個(gè)過程。細(xì)胞周期和癌變不是獨(dú)立存在的，細(xì)胞周期的失調(diào)是細(xì)胞過度增殖而致癌變產(chǎn)生的重要原因[2]。Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路與人類絕大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，該通路中的任何組分發(fā)生突變都會(huì)影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化及凋亡。目前研究表明在許多惡性腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)Ras通路的異常激活。在黑素瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌中等多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了Ras的改變，Ras基因具有抑制腫瘤的功能[3]。CyclinD1是主要的G1期正調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)細(xì)胞G1-S期時(shí)相的轉(zhuǎn)換，被認(rèn)為是原癌基因[4]過度表達(dá)的CyclinD1蛋白促進(jìn)G/S期的轉(zhuǎn)換，從而加速腫瘤的發(fā)生進(jìn)程[5]。因此，對(duì)Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究，不僅對(duì)認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)防有重要意義，而且還可以通過干擾該通路的過度激活而達(dá)到在基因水平上治療腫瘤的目的。因此，研究者采用免疫組化技術(shù)檢測了不同病理類型、不同臨床分期的宮頸癌患者組織中k-ras和CyclinD1蛋白的表達(dá)情況，以探討其與宮頸癌的關(guān)系及相關(guān)的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象和臨床資料

1.1.1 宮頸癌(實(shí)驗(yàn))組 選取內(nèi)蒙古包頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科2009—2011年經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為宮頸癌的組織標(biāo)本15例，所有患者臨床資料完整，術(shù)前均未行放、化療。

1.1.2 CIN(實(shí)驗(yàn))組 選取內(nèi)蒙古包頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科2009—2011年經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為CINⅠ的組織標(biāo)本20例，CINⅡ的組織標(biāo)本18例，CINⅢ的組織標(biāo)本12例，所有患者臨床資料完整，術(shù)前均未行放、化療。

1.1.3 正常宮頸(對(duì)照)組 選取經(jīng)病理學(xué)檢查確診為正常宮頸的組織標(biāo)本20例，所有患者臨床資料完整。

1.2 主要試劑 k-ras和CyclinD1蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司，即用型SP免疫組化超敏試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.3 免疫組化檢測 標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋組織，常溫保存?zhèn)溆谩? μm石蠟切片常規(guī)脫蠟后，分別用于常規(guī)HE染色和免疫組化染色，免疫組化染色切片于3%過氧化氫甲醇液中室溫浸泡10～15 min阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，檸檬酸鈉緩沖溶液中高壓鍋加熱2 min進(jìn)行抗原修復(fù)，1%小牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加入一抗k-ras或CyclinD1蛋白抗體，抗體稀釋比例均為1∶100，置于濕盒中4℃過夜，PBS沖洗滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫繼續(xù)孵育30 min，PBS沖洗后DAB顯色，洗滌，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。k-ras蛋白細(xì)胞陽性結(jié)果為細(xì)胞核和(或)胞漿的黃色或棕黃色染色顆粒；CyclinD1蛋白以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽性表達(dá)細(xì)胞；陰性表達(dá)細(xì)胞呈藍(lán)紫色。陽性標(biāo)準(zhǔn)：在高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性表達(dá)，＞10%為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。相關(guān)性分析采用Pearson。

2 結(jié)果

2.1 k-ras蛋白和CyclinD1蛋白免疫組化在宮頸癌組織中的表達(dá)情況 k-ras蛋白細(xì)胞陽性結(jié)果為細(xì)胞核和(或)胞漿的黃色或棕黃色染色顆粒；CyclinD1蛋白以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽性表達(dá)細(xì)胞；陰性表達(dá)細(xì)胞呈藍(lán)紫色(圖1)。

2.2 k-ras蛋白在不同臨床分期的表達(dá)情況比較 k-ras蛋白定位于細(xì)胞核，與正常組織比較，k-ras蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)明顯增高(P＜0.05)。隨著臨床分期的增加k-ras蛋白則隨著宮頸癌臨床分期的增加陽性率顯著升高(P＜0.05，表1)。

2.3 CyclinD1蛋白在不同期別的表達(dá)情況比較 CyclinD1蛋白定位于細(xì)胞核，與正常組織比較，CyclinD1蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)明顯增高(P＜0.01)。隨著臨床分期的增加CyclinD1蛋白則隨著宮頸癌臨床分期的增加陽性率顯著性升高(P＜0.01，表2)。

2.4 CyclinD1蛋白在宮頸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 在宮頸癌中，CyclinD1的陽性表達(dá)率在年齡、病理類型之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表3)。

圖1 k-ras蛋白和CyclinD1蛋白免疫組化在宮頸癌組織中的表達(dá)

表1 k-ras蛋白在不同期別的表達(dá)情況比較

表2 CyclinD1蛋白在不同期別的表達(dá)情況比較

表3 CyclinD1蛋白在宮頸癌中的表達(dá)

2.5 k-ras蛋白在宮頸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系在宮頸癌中，k-ras的陽性表達(dá)率在年齡、病理類型之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在組織學(xué)分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表4)。2.6 CyclinD1蛋白與k-ras蛋白相關(guān)性研究 在36例卵巢上皮癌中，CyclinD1的表達(dá)與k-ras呈正相關(guān)(r＝0.52，P＜0.00，表5)。

表4 k-ras蛋白在宮頸癌中的表達(dá)

表5 CyclinD1蛋白與k-ras蛋白相關(guān)性

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)逐步的多階段過程，主要與癌基因的激活與抑癌基因的失活及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制失衡等病理改變有關(guān)，引起細(xì)胞異常改變，導(dǎo)致組織癌變[6]。近年來有關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性研究已成為新的研究方向，目前對(duì)Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路及其下游靶基因CyclinD1在腫瘤研究很多，像在瘢痕組織中研究多見，認(rèn)為Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路及其下游靶基因CyclinD1的異常表達(dá)或基因突變，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。Ras基因是一種癌基因，激活后的Ras基因主要是通過Ras/Raf/MAPK和PI3K/AKT兩條通路介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[8]，Ras基因激活后可以激活其下游的MAPK信號(hào)通路而引起MAPK酶級(jí)聯(lián)放大作用，使信號(hào)向下傳遞。在Ras/Raf/MAPK及其下游靶基因CyclinD1信號(hào)傳遞過程中，CyclinD1是信號(hào)通路上的重要靶基因。研究證實(shí)Ras信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)病中以及在控制細(xì)胞生長和分化中起重要作用[9]。有研究報(bào)道Ras癌基因可以通過上調(diào)CyclinD1的表達(dá)加速細(xì)胞周期的進(jìn)程[10]，提示Ras與CyclinD1之間有一定的相關(guān)性。激活的Ras信號(hào)通路使CyclinD1積聚，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入靜息狀態(tài)[11]。CyclinD1是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4/6)結(jié)合后，促使細(xì)胞從G1期順利進(jìn)入S期，使細(xì)胞發(fā)生分裂與增殖，因此CyclinD1蛋白的過度表達(dá)會(huì)使增殖周期不斷進(jìn)行，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。國內(nèi)外的研究已發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在多種腫瘤中表達(dá)明顯增高[12]。

3.1 k-ras蛋白與CyclinD1蛋白在不同組別的表達(dá)情況分析 本研究發(fā)現(xiàn)，k-ras蛋白與CyclinD1蛋白和正常組織比較，在宮頸癌組織中表達(dá)明顯增高。隨著臨床分期的增加，蛋白則隨著宮頸癌臨床分期的增加陽性率顯著升高。這與郭艷萍等[12]有關(guān)CyclinD1蛋白的研究結(jié)論一致，與胡成久等[13]對(duì)于皮膚瘢痕癌中關(guān)于k-ras蛋白研究結(jié)論一致，說明CyclinD1蛋白、k-ras蛋白的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，并可以作為判斷宮頸癌臨床進(jìn)展的指標(biāo)。

3.2 k-ras蛋白與CyclinD1蛋白在宮頸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 在對(duì)年齡組和宮頸癌組織分型中發(fā)現(xiàn)，k-ras蛋白與CyclinD1蛋白表達(dá)沒有差別，而在分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移方面有差異，這與汪鑫和白冬雨等[14-15]報(bào)道關(guān)于k-ras基因表達(dá)與那些因素相關(guān)的結(jié)論部分一致。k-ras蛋白在宮頸癌的不同時(shí)期表達(dá)均明顯高于正常，并隨分化程度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而升高，說明k-ras作為癌基因啟動(dòng)基因，其表達(dá)高可以激活CyclinD1表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌組織癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究中k-ras高表達(dá)者大部分為組織學(xué)分化低、轉(zhuǎn)移率發(fā)生高的患者，提示k-ras蛋白和基因的檢測可以作為宮頸癌嚴(yán)重程度參考指標(biāo)之一。CyclinD1在宮頸癌的不同時(shí)期表達(dá)均明顯高于正常，并隨分化程度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而升高，這與郭艷萍等[12]研究相似，說明CyclinD1作為癌基因在宮頸癌組織的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究中CyclinD1高表達(dá)者大部分(50%以上)為組織學(xué)分化低、轉(zhuǎn)移率發(fā)生高的患者，提示CyclinD1蛋白可作為預(yù)測宮頸癌預(yù)后的參考指標(biāo)之一。

3.3 CyclinD1蛋白與k-ras蛋白相關(guān)性 本研究發(fā)現(xiàn)CyclinD1蛋白與k-ras蛋白呈正相關(guān)，有關(guān)此研究報(bào)道較少，但是本研究證實(shí)了宮頸癌發(fā)生時(shí)通過k-ras激活Ras/Raf/MAPK通路及其下游靶基因CyclinD1信號(hào)傳遞而實(shí)現(xiàn)的，所以其表達(dá)具有相關(guān)性。

綜上所述，腫瘤的發(fā)生是各相關(guān)基因相互作用的結(jié)果，而引起細(xì)胞增殖周期紊亂并導(dǎo)致細(xì)胞的無調(diào)控增殖。Ras/Raf/MAPK→CyclinD1信號(hào)傳導(dǎo)通路上的靶基因Ras、MAPK、CyclinD1三者的關(guān)系密切，Ras蛋白的過度表達(dá)是開啟此信號(hào)通路的鑰匙，而MAPK蛋白的表達(dá)則把信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，最終信號(hào)通路上的所有信號(hào)激活CyclinD1，CyclinD1的異常表達(dá)使細(xì)胞的增殖失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[16]。

[1]Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J]. CA Cancer J Clin，2010，60(5)：277.

[2]Anderson MC.Invasive carcinoma of the cervix following local destructive treatmentforcervicalintraepithelialneoplasia[J]. Br J Obstet Gynecol，1993，100(7)：657-663.

[3]McCubreyJA，Steelman LS，ChappellWH，etal.Rolesof the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth，malignant transformation and drug resistance[J].Biochim Biophys Acta，2007，1773(8)：1263-1284.

[4]Chang ZG，Wei JM，Qin CF，et al.Receptor inhibits epithelial mesenchymal transition in human pancreatic cancer PANC-1 cells[J].Dig Dis Sci，2012，57(5)：1181-1189.

[5]GaoP，Zhou GY，Liu Y，etal.Alteralion ofcyclinD1 in gastric carcinoma and its clincopathologic significance[J].World J Gastrornterol，2004，10(20)：2936-2939.

[6]張曉金，歸綏琪.宮頸癌發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國婦幼健康研究，2008，19(1)：56-59.

[7]趙萌，劉月平，劉世正，等.食管鱗癌中ERK及其活化形式蛋白的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27(11)：1173-1176.

[8]Mccubrey JA，Steelman LS，ChappellWH，etal.Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth malignant transformationand drug resistance[J].Biochim Biophys Acta，2007，1773 (8)：1263-1264.

[9]鄧開玉，田小英.PTEN和K-ras與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志，2011，18(15)：1217-1220.

[10] 喻小蘭，盧科蓮，夏紀(jì)毅，等.Ras、CyclinD1在宮頸癌中的表達(dá)及黃芩素對(duì)其表達(dá)的影響[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2014，28(2)：19-22.

[11]Coleman ML，MarshallCJ，Olson MF.Ras promotes p21 (Waf1/Cip1)protein stability via a cyclin D1-imposed block in proteasome-mediated degradation[J].EMBO J，2003，22 (9)：2036-2046.

[12]郭艷萍，楊廣英，王建君.PTEN、STAT3和CyclinD1蛋白在宮頸癌中的表達(dá)及意義[J].中國婦幼保健，2012，27 (15)：2344-2346.

[13]胡成久，郭瑞珍.K-RAS蛋白的表達(dá)、基因突變?cè)谄つw瘢痕癌組織中的意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23 (1)：22-253.

[14] 汪鑫，聶紹發(fā)，徐曉，等.大腸癌中p21基因表達(dá)的研究[J].九江醫(yī)學(xué)，2003，18(2)：63-65.

[15] 白冬雨，張海萍，鐘山，等.結(jié)直腸癌K-ras基因突變位點(diǎn)的檢測及其臨床意義[J].中國普通外科雜志，2012，21(10)：1222-1226.

[16]郭瑞珍，王海青，歐小波.Ras、MAPK、CyclinD1與皮膚瘢痕癌的相關(guān)性研究[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29(4)：393-397.

Objective To detect CyclinD1 and k-ras in cervical cancer tissue(experimental group)and in normal cervical tissue(control group)，and the differences in the expression level of CINⅠ，CINⅡ，and CINⅢ，to explore their function and possible molecular mechanisms in development and progression of cervical diseases and so as to provide theoretical basis for the study of the etiology of cervical cancer.Methods Immunohistochemistry was adopted to detect the expression status of CyclinD1 and k-ras among 15 cases with cervical cancer，20 cases with normal cervical tissue，18 cases with CINⅠ，12 cases with CINⅡand 20 cases with CIN，and the interrelation between CyclinD1 and k-ras and the development and progression of cervical diseases.Results The expression of CyclinD1 and k-ras was significantly higher in cervical cancer tissue than in normal tissue.With increasing clinical stage，the protein expression increased with differences of statistical significance(P＜0.05).The expression of CyclinD1 and k-ras was not statistically different in ages and the types of cervical cancer tissue(P＞0.05)，while the differences were of statistical significance in differentiation degree and lymphatic metastasis.The expression was 66.7%and 59.3%in poorly differentiated group，while 23.7%and 28.9%in highly and moderately differentiated group.It was 54.8%and 63.0%in lymphatic metastasis group，which was significantly positively correlated with the expression of CyclinD1 and k-ras. Conclusion It was closely related to the high k-ras and CyclinD1 protein expression and the occurrence of cervical cancer，and the various proteins play a role of synergies；Expression strenth of k-ras CyclinD1 in cervical diseases get enhanced，and both were significantly correlated.

CyclinD1；k-ras；Cervical cancer

2014-05-26)

1005-619X(2014)09-0775-03

10.13517/j.cnki.ccm.2014.09.004