烏蘭十三味湯散顯微鑒別及其中苦參堿、氧化苦參堿和梔子苷的測定

包桂花，其樂格爾，包同力嘎

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古通遼 028300)

蒙藥烏蘭十三味湯散載自《觀者之喜》第五章收錄之“烏蘭-13(別名為瑪日欽朱素木或白脈紅湯)”［1］，之后《蒙藥驗(yàn)方》及《中國醫(yī)學(xué)百科全書·蒙醫(yī)學(xué)》均有記載［2-3］。1984年載入《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》，方名為 “伊赫-烏蘭-13湯”［4］。1998年升入國家標(biāo)準(zhǔn)，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊)，方名改為烏蘭十三味湯散或?yàn)跆m-13［5］。由苦參、土木香、懸鉤子木、山柰、訶子、梔子、川楝子等十三味藥材組成，具有清血熱功效。用于血熱上盛，頭痛，目赤，高血壓癥。由于苦參堿和氧化苦參堿具有鎮(zhèn)痛、解熱、降溫和降血壓之功效［6］;梔子苷多用于解熱鎮(zhèn)痛、抗炎等癥［7］，其上述指標(biāo)的功效正與該制劑的藥效相吻合，故選擇以上指標(biāo)成分進(jìn)行測定，為該藥的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

LC-20AT和LC-10ATvp泵 (日本島津)，SPDM20A、CBM-20A、SPO-10Avp檢測器 (日本島津)，LCsolution和N3000色譜工作站;ADW220D型電子分析天平(日本島津);KQ-100超聲波清洗器 (昆山);MODEL ECLIPSE E200彩色生物顯微圖像分析系統(tǒng) (尼康);苦參堿 (批號(hào)110805-200508)、氧化苦參堿 (批號(hào)110780-20100)和梔子苷 (批號(hào)110749-200613)購自中國藥品生物制品檢定所，純度均＞98%;蒙藥烏蘭十三味湯散由阜新蒙藥有限責(zé)任公司 (簡稱阜新蒙藥，批號(hào)20121201)、內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司 (簡稱奧特奇蒙藥，批號(hào)120821)、內(nèi)蒙古庫倫蒙藥股份有限公司 (簡稱庫倫蒙藥，批號(hào)121115)提供;乙腈和甲醇為色譜純，水為超純水，其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參堿和氧化苦參堿的測定

2.1.1 色譜條件 Inersii-NH2柱(250 mm×4.6mm，5 μm)，體積流量1.0 mL/min，流動(dòng)相為乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液 (80∶10∶10)，柱溫25 ℃，檢測波長 220 nm，進(jìn)樣量 10 μL［8-10］。

2.1.2 混合對照品溶液配制 精密稱取苦參堿4.98 mg、氧化苦參堿6.03 mg，各置10 mL量瓶中，加乙腈-無水乙醇 (80∶20)使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別作為對照品貯備液。精密量取以上貯備液各0.5 mL，置10 mL量瓶中加乙腈-無水乙醇制成每1 mL含苦參堿25 μg、氧化苦參堿30 μg的混合溶液。即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取樣品 (批號(hào)121115)約2.0 g，精密加入0.5 mL濃氨試液和20 mL三氯甲烷，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率33 kHZ)，放冷，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL，置中性氧化鋁柱 (內(nèi)徑2 cm，100～200目，10 g，)上，分別用20 mL三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (7∶3)洗脫，收集洗脫液并濃縮至干，殘?jiān)訜o水乙醇溶解，置10 mL量瓶中后稀釋至刻度，即得。按處方量制備不含苦參陰性樣品，依照該方法制備陰性樣品溶液，在此條件下的色譜圖見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的對照品，取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積值。以苦參堿和氧化苦參堿為橫坐標(biāo)，以苦參堿 (YC)和氧化苦參堿 (YD)的色譜峰峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。YC=49671x－2319.7(r=0.9997)，YD=87028x －7019.8(r=0.9998)。結(jié)果苦參堿在0.05～0.35 μg、氧化苦參堿在0.06～0.42 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下的供試品10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積的RSD為苦參堿0.53%、氧化苦參堿1.49%，說明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品 (批號(hào)121115)供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，結(jié)果峰面積的RSD為苦參堿0.68%、氧化苦參堿1.71%，故供試品溶液10h穩(wěn)定性好。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品 (批號(hào)121115)約2.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)下的方法分別制備6份供試品溶液，依照“2.1.1”項(xiàng)測定，故峰面積的RSD為苦參堿1.34%、氧化苦參堿1.26%，說明此法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的樣品(批號(hào)121115)約1.0g，精密加入“2.1.2”項(xiàng)下的對照品貯備液0.6 mL和0.45 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.1.9 樣品測定 取樣品 (批號(hào)121115、20121201、120821)約 2.0 g，按 “2.1.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)擬定條件下測定，結(jié)果見表2。

2.2 梔子苷測定

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)，體積流量1.0 mL/min，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液 (25∶75)，柱溫25℃，檢測波長 238 nm，進(jìn)樣量 10 μL［9-10］。

表1 烏蘭十三味湯散的回收率Tab.1 Results of recovery tests for Wulan Thirteen Herbs’Powder

表2 不同廠家產(chǎn)烏蘭十三味湯散的測定結(jié)果Tab.2 Determination results of Wulan Thirteen Herbs’Powder from different manufacturers

2.2.2 對照品溶液配制 精密稱取梔子苷4.3 mg，加甲醇制成43 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取樣品0.7 g，加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。按處方量制備不含梔子陰性樣品，依照該方法制備陰性樣品溶液，在此條件下的色譜圖見圖2。

2.2.4 考察線性關(guān)系 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的對照品2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL注入液相色譜儀，測定峰面積值。以梔子苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，梔子苷 (YD)的色譜峰峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。YD=39182x+5908(r=0.9999)。結(jié)果梔子苷在0.1075～0.5375 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下的供試品10 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積的RSD為0.98%。說明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品 (批號(hào)121115)供試品溶液 10 μL，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，結(jié)果峰面積的RSD為1.06%。表明12 h測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品 (批號(hào)121115)約0.7 g，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法分別制備6份供試品溶液，依照“2.2.1”方法測定，峰面積的RSD為1.38%，該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的樣品 (批號(hào)121115)約0.35 g，精密稱定，加“2.2.2”項(xiàng)下對照品貯備液2 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.9 樣品測定 取樣品 (批號(hào)121115、20121201、120821)約 0.7 g，按 “2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)擬定條件下測定。結(jié)果見表2。

2.3 顯微鑒別 取樣品粉末，在顯微鏡下觀察，晶纖維，多呈束，纖維細(xì)長，直徑11～27 μm，壁甚厚，非木化，孔溝不明顯，胞腔線形，草酸鈣方晶呈類雙錐形，菱形或多面性 (苦參);木化細(xì)胞，較多，成片，淡黃色，呈類方形、類多角形、類三角形、長方形或不規(guī)則形，邊緣有突起或短分支，或一端擴(kuò)大如靴形，直徑22～54 μm，擴(kuò)大部分可至136 μm，壁厚2～6 μm，木化，孔溝密集，圓點(diǎn)狀，斜裂縫狀或人字狀 (訶子);內(nèi)果皮石細(xì)胞，無色或黃色，常上下層交錯(cuò)排列或纖維連接。呈類長方形、類圓形或類三角形，直徑14～34 μm，胞腔內(nèi)常含草酸鈣方晶，有的并含砂晶 (梔子);果皮晶纖維，淡黃色，呈束，常上下層交錯(cuò)排列或排列不整齊，纖維長短不一，稍彎曲，末端鈍圓，直徑9～36 μm，含晶細(xì)胞壁厚薄不一，木化 (川楝子);非腺毛大型，單細(xì)胞，多彎曲成人字形，頂端鈍圓，基部狹窄，完整者長至1260 μm，中部直徑86 μm，壁厚2～7 μm，微木化，較粗者壁有網(wǎng)狀紋理 (枇杷葉);菊糖眾多，無色，呈不規(guī)碎塊狀(土木香);花粉粒深黃色，散在，類圓形，直徑16～20 μm，外壁厚約至2 μm，光切面觀外壁光滑(金蓮花)，結(jié)果見圖 3［11-13］。

圖3 烏蘭十三葉湯散顯微特征圖 (10×10)Fig.3 Wulan Thirteen Herbs’Powder microscopic characteristic figures(10×10)

3 討論

3.1 采用HPLC法測定烏蘭十三味湯散中苦參堿和氧化苦參堿的量，選取甲醇-無水乙醇-3%磷酸溶液 (80∶10∶10)為流動(dòng)相時(shí)陰性對照樣品有干擾;以乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液 (80∶10∶10)為流動(dòng)相時(shí)陰性對照樣品無干擾且分離度大于1.5，但樣品和對照品被測組分的保留時(shí)間稍有變化，經(jīng)加標(biāo)試驗(yàn)，證實(shí)樣品中的分別是苦參堿和氧化苦參堿。

3.2 在上述色譜條件下，理論板數(shù)按苦參堿峰和梔子苷的峰計(jì)算分別高于2000和1500。

3.3 目前該制劑無質(zhì)量控制方法，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測定苦參堿、氧化苦參堿、梔子苷的量，該方法簡便，重復(fù)性好，為制定烏蘭十三味湯散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

3.4 顯微鑒別時(shí)，每批最少做3張，在顯微鏡下每張片觀察3～6個(gè)視野，觀察每個(gè)視野時(shí)應(yīng)自上左至下右逐漸轉(zhuǎn)動(dòng)粉末片，并全面地觀察，將觀察到的有關(guān)特征與單味藥的顯微特征進(jìn)行對照，將顯著并重復(fù)性好的苦參、訶子、梔子、川楝子、枇杷葉、土木香、金蓮花等的顯微特征用于該品的鑒別特征。

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