補骨脂對小鼠肝細(xì)胞形態(tài)、肝功能及線粒體膜電位的影響

張秀娟，曹慧琪，邢志華，季宇彬*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心生物安全評價研究所，黑龍江哈爾濱 150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150076;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076)

補骨脂是中醫(yī)臨床治療脾腎陽虛的常用補虛藥物［1］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為補骨脂具有補腎助陽，固精縮尿，暖脾止瀉，納氣平喘等功效，主治腎虛冷泄，遺尿尿頻，陽痿，遺精，虛寒喘咳，腰膝冷痛等病癥［2］;現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該藥具有擴張冠狀動脈，抗菌，抗衰老的作用，對平滑肌有雙向調(diào)節(jié)作用，以及抗腫瘤等藥理活性［3-4］。補骨脂藥材、炮制、化學(xué)、藥理作用及臨床應(yīng)用等在國內(nèi)外都有了多方面的研究報道，但是長期使用補骨脂對機體損傷方面的研究甚少。故本課題旨在通過觀察肝臟病理組織、血清學(xué)、細(xì)胞學(xué)變化規(guī)律，分析補骨脂對小鼠肝損傷作用，并探討其安全用量范圍，為今后安全、合理、有效用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物 補骨脂購自哈爾濱人民同泰藥店，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院金哲雄教授鑒定為豆科補骨脂屬植物補骨脂Psoralea corylifolia的干燥成熟果實。

1.2 動物 昆明種小鼠 (20±2)g，雌雄各半，合格證為黑動字第POO101006號，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 試劑與儀器 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒，南京建成生物工程研究所;Adventurer萬分之一電子天平，OHAUS公司;高速離心機，Beckman Coulter;超細(xì)勻漿器，德國FLUKU F6/10;低速離心機，北京醫(yī)用離心機廠 LD4-2A;SUNRISE酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司;流式細(xì)胞儀，美國BECK-COULTER公司;OLYMPUS IX70倒置顯微鏡，Olympus公司。

2 方法

2.1 實驗動物分組及給藥 小鼠40只，隨機分成4組，分別為對照組、補骨脂組 (6.0、3.0、1.5 g/kg)，灌胃，28 d。

2.2 補骨脂對小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 取小鼠肝臟適量切成小塊，PBS沖洗，石蠟包埋，H.E.染色。

2.3 補骨脂對小鼠血清ALT、AST的影響 眼球取血，3000 r/min離心10 min，分離血清，紫外分光光度法測定ALT、AST活性。

2.4 補骨脂對小鼠血清TNF-α、IL-6活性的影響 眼球取血，3000 r/min離心10 min，分離血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗測定TNF-α、IL-6活性。

2.5 補骨脂對小鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.5.1 肝細(xì)胞的分離純化 小鼠肝臟適量切成小塊，PBS沖洗，胰酶37℃消化15 min，小牛血清中止，300目尼龍網(wǎng)過濾，1000 r/min，10 min，棄上清，收集沉淀細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度約為1×106個/mL。

2.5.2 線粒體膜電位的測定 取500 μL細(xì)胞懸液，加染色液500 μL，使其終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，37℃孵育30 min，加1 mL PBS，1000 r/min離心10 min，棄上清，加1 mL PBS，300目尼龍網(wǎng)過濾到流式管中，流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長630 nm。

2.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行方差分析。所有數(shù)據(jù)用表示，數(shù)據(jù)分析用方差檢驗。

3 結(jié)果

3.1 補骨脂對小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖1所見，對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)無擴大，肝索排列整齊，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無腫大、脂變、壞死及明顯炎細(xì)胞浸潤;補骨脂各組則出現(xiàn)肝細(xì)胞輕度病變，1.5 g/kg組發(fā)現(xiàn)少量小壞死病灶;3.0 g/kg組不僅出現(xiàn)小壞死灶，且有肝細(xì)胞腫脹現(xiàn)象;6.0 g/kg組組織切片顯示為小壞死灶增多。

圖1 補骨脂對小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 (40×10)

3.2 補骨脂對小鼠血清ALT、AST的影響 6.0、3.0 g/kg組ALT和AST活性與對照組相比均有顯著的上升，說明補骨脂對小鼠肝功能具有明顯的損傷作用。見表1。

表1 補骨脂對小鼠血清ALT和AST活性的影響 )

表1 補骨脂對小鼠血清ALT和AST活性的影響 )

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別 劑量/(g·kg－1)動物數(shù)/只ALT/(U·L－1)AST/(U·L－1)－ 10 31.8±4.93 57.7±8.97補骨脂組 1.5 9 41.5±3.63 67.5±9.55補骨脂組 3 8 46.2±7.90* 75.6±8.79*補骨脂組 6 8 66.5±8.64＊＊ 93.0±5.33對照組＊＊

3.3 補骨脂對小鼠血清TNF-α、IL-6活性的影響 與對照組比較，TNF-α活性6.0 g/kg組顯著升高;6.0、3.0 g/kg組IL-6活性與對照組相比均顯著升高，說明補骨脂對小鼠肝功能具有明顯的損傷作用。見表2。

表2 補骨脂對小鼠血清 TNF-α和 IL-6活性的影響

表2 補骨脂對小鼠血清 TNF-α和 IL-6活性的影響

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別 劑量/(g·kg －1)動物數(shù)/只TNF-α/(U·L －1)IL-6/(U·L －1)對照組 － 10 37.4±5.68 25.9±0.975補骨脂組 1.5 10 53.5±10.7 28.6±2.65補骨脂組 3 9 59.8±9.60 31.1±1.28*補骨脂組 6 8 101.5 ±24.5＊＊ 42.7±3.07＊＊

3.4 補骨脂對小鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位的影響 如圖2所示。肝細(xì)胞中強熒光部分細(xì)胞所占百分比逐漸減少，隨著藥物劑量的升高其比例的減少更加顯著，并呈一定的劑量依賴關(guān)系，說明補骨脂可使小鼠肝細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位明顯下降，致肝細(xì)胞損傷。

圖2 補骨脂對小鼠肝細(xì)胞線粒體Δψm的影響

4 討論

中藥肝毒性研究已成為中醫(yī)藥界關(guān)注熱點問題，正確合理的評價中藥毒性已成為當(dāng)今中藥研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題之一。進入機體的各種外源物質(zhì)最終都會在肝臟內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)化、貯留，可直接或通過代謝作用間接損害肝臟，誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死、炎癥等病理改變，造成急性、慢性等不同程度的肝臟疾?。?-6］。外源性刺激引起動物肝臟發(fā)生損傷時均可引起血清轉(zhuǎn)氨酶活性的升高［7-8］，其中血清 ALT及AST水平可在一定程度上反應(yīng)肝臟的功能狀態(tài)。細(xì)胞因子是機體防御系統(tǒng)的主要部分，外界條件刺激會對各種細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生促進作用，進而導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì) (TNF-α、IL-6)釋放［9-11］，產(chǎn)生過多亦可損傷肝細(xì)胞。正常情況下，線粒體跨膜電位是維持線粒體進行氧化磷酸化、產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件，是線粒體發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)。線粒體不僅可以通過氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷 (ATP)為機體供能外，還具有很多其他重要功能，如參與細(xì)胞內(nèi)鈣自穩(wěn)平衡、pH值的調(diào)節(jié)等，特別在細(xì)胞生存和壞死的調(diào)控中起決定性功能，細(xì)胞壞死時線粒體的形態(tài)和功能發(fā)生一系列變化［12-13］。研究結(jié)果顯示補骨脂能引起小鼠肝細(xì)胞腫脹、壞死，血清學(xué)結(jié)果顯示，ALT、AST活性低劑量組較空白組有增加趨勢但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，高、中劑量組顯著增加;TNF-α、IL-6活性低劑量組較空白組有增加趨勢但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，高、中劑量組顯著增加;肝細(xì)胞線粒體膜電位 (ΔΨm)隨著給藥劑量的增加顯著降低。說明補骨脂對小鼠肝臟具有明顯的損傷作用。

綜上所述，補骨脂經(jīng)長期大劑量給藥對小鼠體質(zhì)量、肝組織、肝功能酶都有明顯的影響，而且對肝細(xì)胞有損傷作用，表現(xiàn)為引起肝細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，肝細(xì)胞壞死。提示補骨脂大劑量使用可對小鼠肝臟造成一定的損害。

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