莪術(shù)油中3種倍半萜類化合物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用的研究

王佳麗，王 秀，夏 泉，3*，汪 楠，芮 盼

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032;2.銅陵市人民醫(yī)院藥劑科，安徽銅陵 244000;3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230022)

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Valeton、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsinensis S.G.Lee et C.F.Liang和溫莪術(shù)Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，具行氣破血、消積止痛的功效［1］。莪術(shù)的主要成分為揮發(fā)油［2］(莪術(shù)油，zedoary turmeric oil，ZTO)，是莪術(shù)經(jīng)過水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，具有抗腫瘤［3］、抗血栓［4］、抗菌抗病毒［5］等作用，為莪術(shù)發(fā)揮傳統(tǒng)功效的主要活性成分，莪術(shù)油主要含有莪術(shù)二酮、β-欖香烯、異莪術(shù)烯醇、莪術(shù)醇和吉馬酮［6］等。從已有的文獻(xiàn)報(bào)道來看，對(duì)從莪術(shù)油中分離單體的藥理作用研究主要集中在莪術(shù)醇和β-欖香烯的報(bào)道，如莪術(shù)醇誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的凋亡［7］，β-欖香烯乳對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用［8］，對(duì)有關(guān)莪術(shù)二酮和吉馬酮藥理研究很少。研究表明，莪術(shù)油對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，包括胃癌SGC-7901細(xì)胞［9］、肺癌 A549細(xì)胞［10］等。莪術(shù)油中分離出的莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇和吉馬酮是否對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有同樣的抑制增殖作用是本研究的主要內(nèi)容。通過MTT法測(cè)定莪術(shù)油及其3種倍半萜化合物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，以及流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)對(duì)細(xì)胞周期變化的影響，以期尋找莪術(shù)油中起抗腫瘤作用的活性成分。3種化合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 莪術(shù)油中3種倍半萜類化合物的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑 莪術(shù)油購自浙江瑞安市制藥廠，莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮為作者單位藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用層析法分離并經(jīng)波譜分析鑒定 (純度99%)［11］。DMEM高糖培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品公司)，胎牛血清 (四季青公司)，雙抗 (Beyotime公司)，MTT、PI、Rnase A、二甲基亞砜均為Sigma公司產(chǎn)品，5-FU(0.5 g/10 mL，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)1212141)。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱 (美國(guó)Thermo Forma公司);multiskan mk3型酶標(biāo)儀 (美國(guó)Thermo Forma公司);XDS-1B倒置顯微鏡 (寧波永新公司);SW-CJ-1D型凈化工作臺(tái) (蘇州凈化);流式細(xì)胞儀 (Bechman coulter公司);Costar 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶 (美國(guó) Corning公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，添加終濃度為100 U/mL的青霉素及鏈霉素，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 用藥及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，配成4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液實(shí)驗(yàn);莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇分別配成終質(zhì)量濃度為94.4、47.2、23.6、11.8、5.9 mg/L，吉馬酮配成終質(zhì)量濃度為 87.4、43.7、21.8、10.9、5.45 mg/L，莪術(shù)油配成終質(zhì)量濃度為944、472、236、118、59 mg/L。陰性對(duì)照組為0.05%無水乙醇稀釋液，陽性藥為12.5 mg/L的5-FU，每個(gè)質(zhì)量濃度5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置一個(gè)正常對(duì)照組。

2.3 MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板，很據(jù)實(shí)驗(yàn)分組用藥，每孔種4000個(gè)細(xì)胞，每孔100 μL細(xì)胞液，100 μL藥液。分別于加藥后24、48、72 h取出培養(yǎng)板，各加入含終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出后每孔加入150 μL的二甲基亞砜，振蕩后，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定對(duì)照組及各用藥組在490 nm波長(zhǎng)的吸收值。用吸收值的結(jié)果計(jì)算相對(duì)抑制率，抑制率=(對(duì)照組吸光度值－加藥組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值×100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞懸液1×106個(gè)/3 mL接種于25 mL的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后每瓶加藥3 mL(莪術(shù)油118 mg/L，莪術(shù)二酮23.6 mg/L，吉馬酮21.8 mg/L，莪術(shù)醇47.2 mg/L)。藥物作用48 h后，胰酶消化后，離心8 min，1000 r/min，小心傾去懸液，加PBS洗2次，離心，1000 r/min，離心8 min，傾去洗液，緩慢加入4 mL的70%冰乙醇，－20℃放置12 h后，離心8 min，1200 r/min，傾去，加1 mL的0.5 μg/mL PI染液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

3 結(jié)果

3.1 MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，莪術(shù)油、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響具有劑量依賴性，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制效果更加明顯結(jié)果見表1。

從圖2可以看出莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮和莪術(shù)油對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，72 h抑制作用最強(qiáng)，抑制作用呈質(zhì)量濃度和時(shí)間依賴性。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響 從表2和圖3中可以看出與正常組相比，莪術(shù)油、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇和吉馬酮能夠阻斷細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞阻滯在G2期，其中莪術(shù)二酮、吉馬酮和莪術(shù)油組能顯著增加G2期的比例。

表1 莪術(shù)油及其3種倍半萜化合物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 (，n=5)

表1 莪術(shù)油及其3種倍半萜化合物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 (，n=5)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

0.464±0.037 0.695±0.010 1.014±0.014莪術(shù)二酮組 5.9 0.454±0.035 0.682±0.010 0.965±0.077*11.8 0.434±0.029 0.650±0.016* 0.848±0.060＊＊23.6 0.386 ±0.054* 0.426 ±0.036＊＊ 0.516 ±0.043＊＊47.2 0.230 ±0.016＊＊ 0.179 ±0.020＊＊ 0.212 ±0.020＊＊94.4 0.126 ±0.004＊＊ 0.132 ±0.022＊＊ 0.138 ±0.048＊＊莪術(shù)醇組 5.9 0.457±0.035 0.663±0.005 0.994±0.07111.8 0.453±0.035 0.612±0.013* 0.901±0.059*23.6 0.451±0.035 0.590±0.033＊＊ 0.869±0.049*47.2 0.413 ±0.018 0.385 ±0.022＊＊ 0.388 ±0.030＊＊94.4 0.164 ±0.015＊＊ 0.169 ±0.020＊＊ 0.232 ±0.047＊＊吉馬酮組 5.45 0.453±0.034 0.573±0.019＊＊ 0.728±0.057＊＊10.9 0.445 ±0.036 0.541 ±0.007＊＊ 0.702 ±0.040＊＊21.8 0.373 ±0.026* 0.399 ±0.011＊＊ 0.530 ±0.035＊＊43.7 0.282 ±0.026＊＊ 0.287 ±0.016＊＊ 0.288 ±0.025＊＊87.4 0.117 ±0.032＊＊ 0.086 ±0.002＊＊ 0.094 ±0.016＊＊莪術(shù)油組 59 0.425±0.036 0.581±0.048＊＊ 0.679±0.056＊＊118 0.389 ±0.034* 0.426 ±0.020＊＊ 0.165 ±0.051＊＊236 0.132 ±0.014＊＊ 0.108 ±0.006＊＊ 0.123 ±0.031＊＊472 0.113 ±0.013＊＊ 0.106 ±0.010＊＊ 0.128 ±0.031＊＊944 0.111 ±0.013＊＊ 0.104 ±0.012＊＊ 0.119 ±0.029＊＊5-Fu 組 12.5 0.320±0.041＊＊ 0.252±0.038＊＊ 0.197±0.00624 h 48 h 72 h正常組組別 質(zhì)量濃度/(mg·L－1) OD 值＊＊

圖2 HepG2細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 莪術(shù)油及其3種倍半萜化合物對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響 (，n=3)%

表2 莪術(shù)油及其3種倍半萜化合物對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響 (，n=3)%

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

G0/G1 G2/M正常組組別 質(zhì)量濃度/(mg·L－1) S期26.98±0.75 62.94±1.27 10.08±0.25莪術(shù)二酮組 47.2 25.48±1.09 59.98±0.40* 14.54±0.99＊＊莪術(shù)醇組 47.2 29.53±0.40* 59.40±0.98* 11.47±1.22*吉馬酮組 21.8 29.60±0.74* 56.02±1.38＊＊ 14.38±0.63＊＊莪術(shù)油組 59 30.86±0.22* 54.28±0.50＊＊ 14.86±0.28＊＊

圖3 流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果

4 討論

4.1 目前對(duì)莪術(shù)油抗腫瘤藥理作用研究結(jié)果主要有直接細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［10］、影響癌細(xì)胞核酸代謝［12］、調(diào)控癌基因、抑癌基因及蛋白表達(dá)［13］、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲及血管生成［14］等。有文獻(xiàn)報(bào)道，莪術(shù)油刺激細(xì)胞后A549細(xì)胞分泌的膠原隨劑量和作用的時(shí)間增加而減少，Cat D、Cat K蛋白的表達(dá)隨作用時(shí)間持續(xù)而增強(qiáng)［15］。對(duì)其中的莪術(shù)醇研究主要為在體外能抑制MCF7、MM231、HeLa、OVUL-2細(xì)胞的增殖，并能阻止 MCF7、MM231、HeLa細(xì)胞RNA的合成［16］。有關(guān)吉馬酮和莪術(shù)二酮的抗癌作用研究很少，僅報(bào)道吉馬酮能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖［17］。本實(shí)驗(yàn)通過莪術(shù)油、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇和吉馬酮作用于HepG2細(xì)胞，進(jìn)而觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示3種單體對(duì)HepG2細(xì)胞都有抑制作用，吉馬酮相對(duì)抑制作用較強(qiáng)，莪術(shù)醇和莪術(shù)油對(duì)細(xì)胞的抑制作用與文獻(xiàn)報(bào)道［18］相一致，說明3種倍半萜類化合物可能是莪術(shù)油中起抗腫瘤活性成分。

4.2 有關(guān)細(xì)胞周期方面，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明莪術(shù)油、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇和吉馬酮能夠阻斷細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞阻滯在G2期。有文獻(xiàn)報(bào)道莪術(shù)醇可使胃癌SGC-7901細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)減少，抑制細(xì)胞DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成［19］。倍半萜類化合物能夠阻滯細(xì)胞周期的G2期的相關(guān)研究已有報(bào)道，如β-欖香烯能上調(diào)卵巢癌A2780細(xì)胞中p21、p27、p53蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于 G2期［20］，莪術(shù)醇能使A549細(xì)胞G2期比例升高［21］。在本實(shí)驗(yàn)中莪術(shù)醇和吉馬酮能使得細(xì)胞周期在G0/G1-S期和S-G2/M期阻滯，莪術(shù)二酮僅表現(xiàn)為S-G2/M期阻滯，推測(cè)這3種物質(zhì)均為倍半萜化合物，對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用相似但又存在一些不同。而莪術(shù)油中含有多種倍半萜類物質(zhì)，除以上3種外，還可能是其他倍半萜類成分起抑制作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4.3 由于倍半萜類化合物的理化性質(zhì)，MTT實(shí)驗(yàn)中溶解時(shí)開始選用的是DMSO，結(jié)果其在保證溶解度的條件下對(duì)細(xì)胞有毒性，后來選用0.05%無水乙醇，實(shí)驗(yàn)證明無水乙醇無細(xì)胞毒性，故選用其為溶劑。莪術(shù)油質(zhì)量濃度的選擇根據(jù)莪術(shù)二酮的質(zhì)量濃度計(jì)算，由于莪術(shù)二酮占莪術(shù)油的10%左右［11］，參考有關(guān)文獻(xiàn)［18］，故選用莪術(shù)二酮質(zhì)量濃度的10倍作為莪術(shù)油的質(zhì)量濃度。

4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)，細(xì)胞數(shù)不夠可能會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果可信度不高。為增大細(xì)胞數(shù)，盡量減少處理過程中的流失，加藥質(zhì)量濃度的選擇依照MTT結(jié)果，3種倍半萜取48 h抑制率在50%左右的質(zhì)量濃度，莪術(shù)油改用59 mg/L。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:257-258.

［2］張清哲，楊 芳，朱晶晶，等.GC-MS比較溫郁金、溫莪術(shù)、片姜黃中揮發(fā)油的化學(xué)組成［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35(19):2590-2593.

［3］宋愛莉，殷玉琨.莪術(shù)油干預(yù)治療腫瘤的研究及應(yīng)用概況［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32(2):172-174.

［4］陳家源，鐘正賢，盧文杰，等.抗血栓藥材醇提取物的篩選研究［J］.廣西醫(yī)藥，2009，31(8):1067-1069.

［5］徐建私，孫愛華.莪術(shù)油滴眼液體內(nèi)外抗菌和抗病毒作用的藥效學(xué)研究［J］.微生物學(xué)雜志，2008，28(2):77-81.

［6］Zhu J J，An Y W，Hu G，et al.Simultaneous determination of multiple sesquiterpenes in Curcuma wenyujin herbal medicines and related products with one single reference standard［J］.Molecules，2013，18(2):2110-2121.

［7］劉健翔，王 娟，蔣曉山，等.莪術(shù)醇誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞凋亡作用及其抗腫瘤機(jī)制探討［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(6):1339-1341.

［8］朱 行，李 華.欖香烯乳對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞株端粒酶活性及細(xì)胞凋亡的影響［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2001，1(4):5-8.

［9］孫宏巖，邵淑麗，李 爽，等.莪術(shù)油對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖和凋亡的影響［J］.齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28(4):33-37.

［10］王曉波，牛建昭，崔 巍，等.莪術(shù)油對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549增殖的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(9):41-43.

［11］夏 泉，劉金旗，彭代銀.莪術(shù)油中莪術(shù)二酮的分離和鑒定［J］.中成藥，2008，30(8):1185-1188.

［12］許振國(guó)，宋愛莉，殷玉琨，等.莪術(shù)油對(duì)大鼠乳腺癌癌前病變組織VEGF mRNA表達(dá)的影響［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(8):570-574.

［13］楊麗華，姜 杰.莪術(shù)油對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，20(12):741-743.

［14］劉曉菲，宋愛莉，李靜蔚.莪術(shù)油對(duì)大鼠乳腺癌癌前病變MVD及相關(guān)調(diào)控因子VEGF/FLK表達(dá)的干預(yù)作用研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(4):19-21.

［15］楊長(zhǎng)福，黃春芳，孫曉芳，等.莪術(shù)油對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞中組織蛋白酶D，K表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37(6):84284-84286.

［16］徐立春，邊可君，劉志敏，等.天然藥物莪術(shù)醇抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及RNA合成影響的初步研究［J］.腫瘤，2005，25(6):570-572.

［17］Zhong Z，Chen X，Tan W，et al.Germacrone inhibits the proliferation of breast cancer cell lines by inducing cell cycle arrest and promoting apoptosis［J］.Eur J Pharmacol，2011，667(1-3):50-55.

［18］唐 淵，李曉輝.莪術(shù)油提取物對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2的抗癌作用及機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(6):790-794.

［19］楊甲平，齊寶寧.莪術(shù)醇對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32(6):69-71.

［20］Li X，Wang G，Zhao J，et al.Antiproliferative effect of β-elemene in chemoresistant ovarian carcinoma cells is mediated through arrest of the cell cycle at the G2-M phase［J］.Cell Mol Life Sci，2005，62(7/8):894 –904.

［21］楊長(zhǎng)福，牛建昭，王繼峰，等.莪術(shù)醇通過降解ECM改變細(xì)胞周期抑制 A549細(xì)胞增殖［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(5):824-826.