梔子環(huán)烯醚萜苷鼻用原位凝膠的制備

楊軍宣，張海燕，周年化，幸 忠，趙成城

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330004;3.重慶希爾安藥業(yè)有限公司，重慶 401121)

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩，涼血、止血、清熱解毒、清利濕熱等功效［1］。梔子的主要有效成分為環(huán)烯醚萜苷類成分，現(xiàn)代研究表明，梔子及其有效成分在消化系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面具有廣泛作用，可用于腦血管疾病的防治［2-3］。由于鼻黏膜在解剖生理上與腦存在獨(dú)特的天然聯(lián)系，鼻腔給藥是近年來腦部疾病防治研究最多的給藥途徑之一，不僅具有藥物吸收迅速，無肝首過效應(yīng)，給藥方便等優(yōu)點(diǎn)，而且還具有向腦內(nèi)遞藥 (腦靶向)的特性［4-5］。本實(shí)驗(yàn)對梔子環(huán)烯醚萜苷鼻用原位凝膠的制備工藝及制劑的物理性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為其新制劑的研究開發(fā)提供參考和依據(jù)。

1 材料

OSMOMAT030型滲透壓計(jì) (德國高能泰克公司);Franz擴(kuò)散池 (青島榮升必達(dá)公司);TT-6D藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀 (天津市正通科技有限公司);HF6A型多頭磁力加熱攪拌器 (常州國華電器有限公司);DM-BA400數(shù)碼光學(xué)顯微鏡 (MOTIC公司);HBDV-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì) (美國BROOKFIELD公司);BP211D電子天平 (德國sartorius);超聲清洗器 (上海必能信超聲有限公司);RE-53C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠);DZF-6050電熱恒溫真空干燥箱 (嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司);超濾離心管 (美國Miliipore公司);TGL-16G型高速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器有限公司);PHS-3C型精密PH計(jì) (上海虹益儀器儀表有限公司)。

去乙酰結(jié)冷膠 (上海眾偉生化有限公司);三羥甲基氨基甲烷 (上海新興化工試劑研究所);甘露醇 (北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司);葡萄糖(重慶大新藥業(yè)股份有限公司);尼泊金甲酯/乙酯(天津市大茂化學(xué)試劑廠);酚紅染料 (上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司);梔子環(huán)烯醚萜苷提取物(自制，總苷含有量50%以上);人工鼻液［自制，離子強(qiáng)度Na+(150±32)mmol/L，K+(41±18)mmol/L，Ca2+(8±4)mmol/L］;其他試劑均為分析純;水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 原位凝膠的制備

2.1.1 輔料種類與用量的考察 本實(shí)驗(yàn)制備離子敏感型原位凝膠。離子敏感型原位凝膠目前最常用基質(zhì)為結(jié)冷膠 (gellan gum)［6］，它是美國Kelco公司開發(fā)的新型藥用輔料，其中去乙酰結(jié)冷膠(DGG)為一線性多糖，當(dāng)溶液中有一價或二價陽離子存在時能與聚合物鏈上的羰基絡(luò)合，形成穩(wěn)定的雙螺旋鏈間氫鍵，每兩條雙螺旋鏈逆向聚集，構(gòu)成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，包裹藥物，形成半固體凝膠態(tài)。本實(shí)驗(yàn)選擇去乙酰結(jié)冷膠 (DGG)作為基質(zhì)，對其用量進(jìn)行研究。

取一定量的結(jié)冷膠，加入適量水，90℃加熱使溶解，分別配制成 0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%的溶液。分別觀察操作難易程度、外觀性狀等;另取凝膠溶液1 mL，加入適量人工鼻液，觀察溶液-凝膠相變離子濃度及時間、黏度變化等指標(biāo)，結(jié)果見表1～3及圖1。

表1 輔料用量的考察Tab.1 Results of excipients amount

表1表明，基質(zhì)用量越大，操作越困難，溶解時間越長。

表2 相變離子濃度及相變時間測定Tab.2 Results of ion concentration and phase change time

表2表明，基質(zhì)用量越大，消耗離子溶液越少，相變時間越短，0.1%基質(zhì)溶液在測定時間內(nèi)不發(fā)生相變。表明輔料的用量必須達(dá)到0.2%及以上。

表3 黏度測定結(jié)果Tab.3 Results of viscosity determination

圖1 凝膠劑黏度變化曲線Fig.1 Viscosity curve of in situ gel

表3、圖1表明，基質(zhì)用量0.1%無明顯的黏度“突躍”過程，溶液沒有發(fā)生明顯的相轉(zhuǎn)變;基質(zhì)用量0.2%及以上有一個明顯的黏度“突躍”過程，發(fā)生相轉(zhuǎn)變，且黏度越大，相轉(zhuǎn)變所需要的離子溶液體積 (人工鼻液)越少。基質(zhì)用量0.2%時發(fā)生相轉(zhuǎn)變的離子溶液體積為8 mL，相當(dāng)于人工鼻液離子強(qiáng)度的1/6時即發(fā)生相轉(zhuǎn)變。

綜上所述，結(jié)冷膠用量為0.2%即可，既可減少輔料的用量，又保證在生理離子濃度下發(fā)生相轉(zhuǎn)變。

2.1.2 pH調(diào)節(jié)劑的考察 由于鼻腔給藥制劑直接作用于鼻黏膜表面，必須考慮pH值及黏膜刺激性問題。為避免刺激鼻黏膜，鼻用制劑的pH一般為5～9之間即可［7］。通過測定，梔子環(huán)烯醚萜苷水溶液的pH值為6.1左右，不需加入pH調(diào)節(jié)劑。或可選用30%三羥甲基氨基甲烷調(diào)節(jié)pH至近中性即可［8］。測定原位凝膠劑的pH為6.2，逐步滴加30%三羥甲基氨基甲烷溶液調(diào)節(jié)pH，邊加邊攪拌。當(dāng)pH為7.0左右時，消耗30%三羥甲基氨基甲烷溶液的體積約為1%(V/V)，此即為pH調(diào)節(jié)劑的用量。

2.1.3 滲透壓調(diào)節(jié)劑的考察 正常人體血漿滲透壓值為0.28～0.32 OSmol/kg，選用常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑葡萄糖或甘露醇進(jìn)行研究。結(jié)果見表4。

表4 滲透壓調(diào)節(jié)劑的考察結(jié)果Tab.4 Results of osmotic pressure determination

表4表明，滲透壓調(diào)節(jié)劑選用葡萄糖，用量為3%即可。

2.1.4 防腐劑的選擇 鼻用制劑可加入適量防腐劑，考慮到本噴霧劑為水溶液制劑，為保證質(zhì)量的穩(wěn)定性，需加入一定的防腐劑。預(yù)試表明，苯甲酸鈉、苯甲醇等防腐劑可能影響制劑穩(wěn)定性。選用制藥及食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的防腐劑尼泊金甲酯或乙酯可以滿足要求，用量為常規(guī)用量0.2%即可。

綜上所述，梔子環(huán)烯醚萜苷原位凝膠的制備工藝為:取藥物8 g，加0.2 g的去乙酰結(jié)冷膠，加100 mL水加熱使溶解，然后加入1%(V/V)30%三羥甲基氨基甲烷溶液和3 g葡萄糖及0.2 g的防腐劑，溶解，即得。

2.2 原位凝膠物理性質(zhì)考察 根據(jù)離子敏感型原位凝膠的質(zhì)量要求［9］，對梔子環(huán)烯醚萜苷原位凝膠的以下物理性質(zhì)進(jìn)行考察。

2.2.1 原位凝膠的微觀結(jié)構(gòu) 參考文獻(xiàn) ［10］，分別取不同原位凝膠一滴于載玻片上，在其中心位置分別滴加一滴含有酚紅染料的人工鼻液，使其充分反應(yīng)后覆上蓋玻片，放入37℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，待水分揮干后冷卻至室溫，光學(xué)顯微鏡下觀察原位凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果見圖2。

圖2 原位凝膠微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Microscopic structure diagrams of in situ gel(variant matrix%)

圖2A表明DGG溶液在滴加去離子水后仍為一線性聚合物，而圖2B、C、D明顯看到DGG與人工鼻黏液反應(yīng)后其微觀結(jié)構(gòu)由棒狀小微管相互聯(lián)結(jié)而形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，并且隨著DGG質(zhì)量濃度的增加這種凝膠結(jié)構(gòu)更加致密。

2.2.2 原位凝膠的外排水量測定 參考文獻(xiàn)，采用離心失水試驗(yàn)［10-11］。取不同原位凝膠，以1∶1與人工鼻液反應(yīng)，靜置2 min使其反應(yīng)完全，小心轉(zhuǎn)移至超濾離心管內(nèi)管中，注意避免破壞凝膠表面，稱重 (記重M0)，以200 r/min離心，于不同時間點(diǎn)取出內(nèi)管分別稱重 (記重M)，以下列公式計(jì)算原位凝膠在外力作用下持水能力，繪制持水能力隨時間的變化曲線。試驗(yàn)結(jié)果見表5和圖3。

表5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DGG溶液形成凝膠后持水力測定結(jié)果(n=3，)Tab.5 Results of water holding capacity of DGG subjected to centrifugation(n=3，)

表5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DGG溶液形成凝膠后持水力測定結(jié)果(n=3，)Tab.5 Results of water holding capacity of DGG subjected to centrifugation(n=3，)

時間/min0.1%原位凝膠/%0.2%原位凝膠/%0.5%原位凝膠/%0100 100 1005 72.43±3.54 80.11±4.66 89.19±2.6710 50.10±2.18 71.80±7.32 78.81±4.4715 41.25±4.51 64.37±5.35 72.35±5.1020 29.39±3.23 58.98±4.36 65.43±3.4325 28.66±2.18 55.38±5.20 63.36±3.6230 26.33±2.67 53.64±4.43 60.05±4.02

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DGG溶液形成凝膠后持水力隨離心時間的變化曲線Fig.3 Water holding capacity of DGG subjected to centrifugation

隨著DGG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，形成凝膠后的持水能力也隨之增加，在外力的作用下，水分可從凝膠中緩慢釋放出來。起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的DGG溶液形成的凝膠持水性相對較差，凝膠結(jié)構(gòu)易被破壞。

2.2.3 原位凝膠的黏附力測定 根據(jù)黏附力測定原理，自制黏附力測定簡易裝置，見圖4，以原位凝膠與鼻黏膜斷裂時單位面積的質(zhì)量 (mg/cm2)為指標(biāo)，能直觀評價凝膠與黏膜的黏附力，且試驗(yàn)操作簡單易行，穩(wěn)定可靠。

圖4 黏附力測定裝置Fig.4 Device for adhesive force determination

取動物鼻黏膜，按圖4所示將黏膜的漿膜面固定于砝碼表面和試驗(yàn)平臺上 (砝碼半徑r/cm，必要時用細(xì)線纏繞固定，計(jì)重M1/g)，在試驗(yàn)平臺的黏膜上均勻涂布原位凝膠100 μL，再滴加100 μL人工鼻液，充分反應(yīng)2 min，然后將砝碼置試驗(yàn)平臺上使上層黏膜與凝膠密切接觸1 min，隨后在平衡桿 (測定之前預(yù)平衡至M1/g)另一端掛上一定質(zhì)量的砝碼 (光電天平環(huán)碼)，直至分開，記錄總質(zhì)量M2/g。按下列公式計(jì)算凝膠與黏膜的黏附力(mg/cm2)。試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 黏附力測定結(jié)果 (n=3，)Tab.6 Results of adhesive force determination(n=3，)

表6 黏附力測定結(jié)果 (n=3，)Tab.6 Results of adhesive force determination(n=3，)

凝膠劑黏附力(mg/cm2)組別 0.1%凝膠劑 0.2%凝膠劑 0.5%24.48±3.05 72.72±7.67 100.32±5.43

結(jié)果表明，輔料用量0.2%的黏附力相當(dāng)于0.1%的3倍。

2.2.4 原位凝膠相變臨界陽離子濃度測定 參考文獻(xiàn) ［12］，在Franz擴(kuò)散池接受室內(nèi)加入原位凝膠1 mL和電磁攪拌子，置于 (32±0.5)℃，200 r/min的恒溫恒速透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀中，平衡20 min后用定量加液器加入人工鼻黏液，記錄使電磁攪拌子完全停止轉(zhuǎn)動所需體積，計(jì)算原位凝膠的相變臨界陽離子濃度。

在含結(jié)冷膠0.1%的原位凝膠1 mL中，剛開始加入人工鼻黏液時電磁攪拌子轉(zhuǎn)動受阻，隨著人工鼻液的加入，電磁攪拌子不會停止轉(zhuǎn)動，反而隨著人工鼻液的增加轉(zhuǎn)速加快，可能是未發(fā)生完全相變，反而被人工鼻液稀釋;含結(jié)冷膠0.2%和0.5%的原位凝膠加入人工鼻黏液時電磁攪拌子轉(zhuǎn)動均受阻，且受阻程度隨體積增加而加大，當(dāng)加入人工鼻黏液0.6 mL時，0.2%原位凝膠的電磁攪拌子完全停止轉(zhuǎn)動。當(dāng)加入人工鼻黏液0.4 mL時，0.5%的原位凝膠的電磁攪拌子完全停止轉(zhuǎn)動。人工鼻黏液的離子強(qiáng)度為Na+(150±32)mmol/L，K+(41±18)mmol/L，Ca2+(8±4)mmol/L［13］，結(jié)果表明，梔子環(huán)烯醚萜苷原位凝膠在陽離子濃度為人工鼻黏液的1/2時即發(fā)生相變。

3 討論

原位凝膠主要有溫度敏感型、pH敏感型和離子敏感型三種類型［14］。離子敏感型原位凝膠與溫度或pH敏感型原位凝膠相比明顯的優(yōu)勢為:(1)輔料用量低 (0.5%以下);(2)鼻黏膜和纖毛毒性小;(3)無須冷藏，使用方便。同時其制備工藝簡便，制劑穩(wěn)定［8］。離子敏感型原位凝膠目前最常用基質(zhì)為結(jié)冷膠 (gellan gum)，它是美國Kelco公司開發(fā)的新型藥用輔料，其中去乙酰結(jié)冷膠(DGG)為一線性多糖，當(dāng)溶液中有一價或二價陽離子存在時能與聚合物鏈上的羰基絡(luò)合，形成穩(wěn)定的雙螺旋鏈間氫鍵，每兩條雙螺旋鏈逆向聚集，構(gòu)成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，包裹藥物，形成半固體凝膠態(tài)。所以本實(shí)驗(yàn)選擇去乙酰結(jié)冷膠 (DGG)作為基質(zhì)制備離子敏感型原位凝膠。

研究結(jié)果表明，梔子環(huán)烯醚萜苷原位凝膠在陽離子濃度為人工鼻黏液的1/2時即發(fā)生相轉(zhuǎn)變;原位凝膠與人工鼻黏液反應(yīng)后形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，包裹藥物;原位凝膠黏附力較好，能有效黏附于鼻黏膜，延長藥物在鼻腔的滯留時間，增強(qiáng)吸收，提高生物利用度;同時原位凝膠持水性較好，凝膠結(jié)構(gòu)不易被破壞，制劑較穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)研究為梔子環(huán)烯醚萜苷新制劑的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了參考。

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