芹菜素對U937細胞增殖凋亡及SALL4基因和Wnt/β-catenin信號通路的影響

劉江華，戴碧濤，張 妮，梁紹燕，于 潔

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，兒科學重慶市重點實驗室，重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地，重慶 400014)

芹菜素 (化學名4'，5，7-三羥基黃酮)是一種多酚類黃酮化合物，廣泛分布于芹菜、洋蔥、橘子等多種水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等藥理活性，其中以抗腫瘤作用最為突出［1-2］。實驗證明，芹菜素對多種腫瘤細胞具有抑制生長和誘導凋亡的作用，如肺癌NCI-H460細胞［3］、胃癌 SGC-7901 細胞［4］、卵巢癌 CAOV3 細胞［5］、膀胱癌BIU-87細胞［6］等。對白血病的研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素在體外能誘導急性早幼粒白血病細胞株HL-60發(fā)生凋亡［7］，在體內(nèi)能夠抑制小鼠移植性白血病腫瘤的生長［8］，但其抗白血病作用的機制尚不明確。

SALL4是新發(fā)現(xiàn)的癌基因，位于20q13，編碼一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，其異常表達與白血病的發(fā)生及預后密切相關。SALL4過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠最終發(fā)生了急性髓細胞白血病，且在不同類型的白血病細胞株及病人中都檢測到了SALL4的高表達;SALL4致白血病的機制可能是通過激活造血干細胞自我更新的重要通路 Wnt/β-catenin通路實現(xiàn)的［9-10］。

芹菜素作為潛在的抗腫瘤藥物，對SALL4基因及Wnt/β-catenin信號通路的影響目前未見報道。本研究選擇急性單核細胞白血病細胞株U937作為研究對象，探討芹菜素對U937細胞增殖凋亡及SALL4基因和Wnt/β-catenin信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 芹菜素 (純度＞95%)、二甲基亞砜 (DMSO)購自Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)購自Hyclone公司;CCK-8試劑購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司;TRIzol試劑購自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅡ熒光染料購自Takara(大連寶生物生物工程有限公司);SALL4多抗購自 GeneTex公司，Bcl-2、Caspase-3單抗購自Cell Signaling公司，β-actin單抗及羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物有限公司。實驗前將芹菜素溶解在DMSO溶劑中，配成39.2 mmol/L的濃縮液，－20℃貯存?zhèn)溆谩嶒灂r用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成芹菜素工作液，DMSO終質(zhì)量分數(shù)在0.4%以下，預實驗證明該質(zhì)量分數(shù)對細胞生長無影響。

1.2 方法

1.2.1 細胞株及細胞培養(yǎng) 人U937細胞株由重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所傳代凍存。復蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化 取對數(shù)生長期的U937細胞，加入不同體積的芹菜素濃縮液，使芹菜素終濃度分別為0、20、40、60 μmol/L(0組為對照組)。培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.3 CCK-8法檢測芹菜素對U937細胞的增殖影響 將不同處理組細胞 (芹菜素終濃度分別為0、20、40、60 μmol/L)以1×105個/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)體系，每組設3個復孔。置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、36 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標儀上測定450 nm波長處每孔細胞的光密度值 (A)。按以下公式計算細胞增殖抑制率 (%)=［(對照孔A值－加藥孔A值)/對照孔A值］×100%，并計算API處理U937細胞24 h的IC50。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀測定細胞周期 收集不同濃度(0、20、40、60 μmol/L)芹菜素處理 24 h 的U937細胞，800 r/min離心5 min，棄上清，預冷PBS洗滌細胞2次，75%乙醇固定細胞。離心重懸細胞后加入碘化丙啶，4℃避光孵育1 h后上流式細胞儀檢測。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 收集不同濃度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素處理24 h后的細胞，800 r/min離心5 min，棄上清，預冷PBS洗滌細胞2次。Binding Buffer重懸細胞后，取195 μL的細胞懸液加入5 μL的Annexin V-FITC，混勻后間隔3 min，再加入10 μL碘化丙啶，室溫避光孵育10 min后上流式細胞儀檢測。

1.2.6 引物設計及合成 根據(jù)GeneBank中人SALL4(NM_020436.3)、C-Myc(NM_002467.4)、CCND1(NM_053056.2)、β-actin(NM_001101.3)基因序列設計引物，引物序列見表1。引物均由上海英駿生物工程有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of real-time PCR primers

1.2.7 熒光定量PCR檢測基因表達水平 收集不同濃度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素處理36 h的細胞，按TRIzol試劑的操作說明提取總RNA，分光光度計測定 RNA濃度及純度，A260/A280為1.8～2.1者用于逆轉(zhuǎn)錄反應。逆轉(zhuǎn)錄條件為:37℃ 15 min，85℃ 5 s。以合成的cDNA為模板，進行熒光定量PCR反應，條件為:95℃預變性30 s，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)，65℃ ～95℃記錄熔解曲線。在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀器上進行反應，以SYBR GreenⅡ作為熒光染料，記錄樣本的循環(huán)閾值 (Ct值)。目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值用ΔCt表示，處理組ΔCt值減去對照組 ΔCt值用ΔΔCt表示，以2－ΔΔCt相對定量法計算各處理組相對于對照組基因表達水平的變化。

1.2.8 Western Blot檢測蛋白表達水平 收集不同濃度 (0、20、40、60 μmol/L)芹菜素處理36 h的細胞，用蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，取50 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2 h，加一抗4℃孵育過夜，一抗稀釋度為SALL4(1∶800)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、β-actin(1∶200)。TBST洗膜3次，加1∶1000稀釋的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h后，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光成像。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson檢驗。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 芹菜素處理后U937細胞形態(tài)的變化 與對照組相比，隨著藥物濃度的增高，處理組的細胞密度逐漸降低，細胞內(nèi)顆粒增多，透明度逐漸下降，細胞碎片增多。其中60 μmol/L處理組可見大量細胞碎片，活細胞少見 (圖1)。

圖1 不同濃度芹菜素處理U937細胞24 h后細胞形態(tài)的變化 (200×)Fig.1 Morphological changes of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(200×)

2.2 芹菜素對U937細胞增殖的影響 與對照組相比，處理組的細胞增殖明顯受抑制 (P＜0.01，表2)。同一時間點隨著藥物濃度的升高，細胞增殖抑制率逐漸增高 (P＜0.05);同一藥物濃度，隨著作用時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸增高(P＜0.05)。說明芹菜素對U937的增殖抑制作用呈時間和劑量依賴性。24h的 IC50=32.18 μmol/L，36 h 的 IC50=22.37 μmol/L。

表2 芹菜素對U937細胞增殖抑制率的影響 (%，，n=3)Tab.2 Inhibition rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

表2 芹菜素對U937細胞增殖抑制率的影響 (%，，n=3)Tab.2 Inhibition rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

注:與對照組比較，＊＊P＜0.01

芹菜素/(μmol·L －1)12 h 24 h 36 h 000020 20.54 ±4.13＊＊ 36.74 ±2.57＊＊ 46.70 ±1.46＊＊40 32.04 ±2.96＊＊ 56.70 ±3.92＊＊ 66.82 ±1.77＊＊60 41.42±3.02＊＊ 66.35±3.34＊＊ 77.86±1.30＊＊

2.3 芹菜素對U937細胞周期的影響 與對照組相比，隨著藥物濃度的升高，G2/M期細胞比例增多 (P＜0.01)，S期細胞比例下降，但差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)(表3，圖2)。提示芹菜素對細胞周期的阻滯發(fā)生在G2/M期，且在一定范圍內(nèi)，與藥物劑量正相關 (P＜0.01)。

表3 芹菜素作用24 h后U937細胞的周期分布 (%，，n=3)Tab.3 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

表3 芹菜素作用24 h后U937細胞的周期分布 (%，，n=3)Tab.3 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for different amount of time(%，，n=3)

注:與對照組相比，*P＜0.05

芹菜素/(μmol·L －1)G0/G1 S G2/M 060.49±6.70 38.91±6.28 0.60±0.4520 53.29±0.58 35.19±1.85 11.52±2.20*40 52.15±2.46 30.56±1.83 18.43±1.14*60 39.87±5.41 27.31±5.59 29.34±0.68*

圖2 芹菜素作用24 h后U937細胞的周期分布Fig.2 Cell cycle of U937 after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h

2.4 芹菜素對U937細胞凋亡的影響 與對照組相比，隨著藥物濃度的升高，細胞凋亡率逐漸增高(P＜0.05)，并在一定范圍內(nèi)有濃度依賴性 (P＜0.05，表4，圖3)。

表4 不同濃度芹菜素作用24 h對U937細胞凋亡率的影響(%，，n=3)Tab.4 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(%，，n=3)

表4 不同濃度芹菜素作用24 h對U937細胞凋亡率的影響(%，，n=3)Tab.4 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h(%，，n=3)

注:與對照組相比，*P＜0.05

芹菜素/(μmol·L－1) 凋亡率/%3.42±1.1320 5.66±0.60*40 7.90±0.26*60 10.86±0.940*

2.5 芹菜素對SALL4及Wnt/β-catenin通路下游靶基因c-Myc、CCND1表達的影響 隨著芹菜素濃度的升高，SALL4、c-Myc、CCND1的表達量逐漸下降。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，表5，圖4)。經(jīng)Pearson相關性分析，SALL4與c-Myc、CCND1表達量正相關，相關系數(shù)分別為0.882和0.662，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。

表5 Real-time PCR檢測芹菜素作用36 h后SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相對表達量 (，n=3)Tab.5 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA by real-time PCR(，n=3)

表5 Real-time PCR檢測芹菜素作用36 h后SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相對表達量 (，n=3)Tab.5 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA by real-time PCR(，n=3)

注:與對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

芹菜素/(μmol·L －1)2 － ΔΔ Ct SALL4 C-MYC CCND101.00±0.12 1.00±0.04 1.00±0.0820 0.76±0.06* 0.71±0.04* 0.51±0.13＊＊40 0.53 ±0.06＊＊ 0.48 ±0.04* 0.36 ±0.05＊＊60 0.37±0.08＊＊ 0.24±0.09* 0.35±0.09＊＊

2.6 芹菜素對SALL4、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響 芹菜素處理U937細胞36 h后，SALL4、Bcl-2蛋白表達水平降低，Caspase-3表達升高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)(圖5)。

圖3 芹菜素作用24 h后U937細胞的凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of U937 cells after beging treated with different concentrations of apigenin for 24 h

圖4 real-time PCR檢測各組細胞SALL4、c-Myc、CCND1 mRNA的相對表達量Fig.4 Determination of relative expression of SALL4，c-Myc and CCND1 mRNA in various groups by realtime PCR

3 討論

化療是兒童急性白血病和其他惡性腫瘤的主要治療手段，大劑量化療可以產(chǎn)生更強的腫瘤細胞凋亡作用;然而化療藥物的毒副作用及耐藥問題嚴重困擾著臨床治療。芹菜素作為一種天然植物成分，因其高效、低毒、無誘變性等特點，逐漸成為新興的研究熱點。本實驗結果顯示，20、40、60 μmol/L的芹菜素都表現(xiàn)出抑制U937細胞增殖的能力，且隨著藥物濃度的升高和時間的延長，抑制作用逐漸增強，呈現(xiàn)出明顯的時間和劑量依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)芹菜素能夠通過調(diào)控凋亡相關蛋白Bcl-2和Caspase-3誘導細胞凋亡，印證了Budhraja的研究結果［8］。細胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡是維持機體正常狀態(tài)的重要條件，腫瘤的形成就是由于惡性細胞增殖加快、凋亡受阻，打破了這種動態(tài)平衡所致。本研究的結果提示芹菜素能夠通過抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡，恢復正常的生理平衡，從而起到抗腫瘤的作用。

圖5 芹菜素處理后各組細胞SALL4、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表達水平Fig.5 Protein expression levels of SALL4，Bcl-2 and Caspase-3 in U937 cells in various groups after apigenin treatment

細胞周期是一個復雜有序的生理過程，對維持機體正常功能具有重要作用，許多化療藥物就是通過作用于特定的細胞周期發(fā)揮作用的，如阿糖胞苷主要作用于S期，長春新堿特異地作用于M期。在細胞周期的調(diào)控過程中，從G0期能否進入S期、從G2期能否進入M期是兩個關鍵點。若能阻斷細胞從某一時相進入下一時相，導致細胞蓄積在特定時相，此時再給予該時相特異性藥物就能夠增強對腫瘤細胞的殺傷作用。本研究通過流式細胞術檢測芹菜素對U937細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的芹菜素處理細胞后，引起G2/M期的細胞增多，說明芹菜素對細胞周期的阻滯作用發(fā)生在G2/M期，與文獻報道一致［11-12］。推測如果把芹菜素與G2/M期特異性化療藥物聯(lián)合應用，既可以增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷性，增加化療藥物的敏感性，又可以減少化療藥物的用量，降低藥物的毒副作用。

SALL4是果蠅Spalt的同源基因，在維持胚胎干細胞的多能性及自我更新中起著重要作用，其突變可導致畸形的發(fā)生，如Okihiro綜合征和IVIC綜合征［13-15］。在正常造血發(fā)育中，SALL4主要表達于CD34

+的造血干/祖細胞，隨著細胞的分化成熟，其表達量逐漸降低，在成熟造血細胞中幾乎不表達，而在白血病細胞中表達升高［10］，提示SALL4可能參與了白血病的發(fā)生。有研究認為SALL4可能通過與β-catenin結合，激活白血病自我更新的重要通路 Wnt/β-catenin 信號通路［9］。c-Myc和 CCND1是Wnt通路中重要的下游靶基因。c-Myc是早期發(fā)現(xiàn)的原癌基因，控制細胞的增殖和分化，與腫瘤的發(fā)生密切相關。CCND1編碼的CYCLIN-D1是細胞周期調(diào)節(jié)的重要因子，過表達可以促進細胞增殖。通過RNA干擾技術抑制SALL4的表達后發(fā)現(xiàn)，β-catenin 和 c-Myc、CCND1 的表達隨之下調(diào)［11］，提示阻斷SALL4可以抑制Wnt信號通路的傳導，從而可能抑制腫瘤的發(fā)生。關于芹菜素對SALL4基因及Wnt/β-catenin信號通路的作用，此前尚未見報道。本研究通過熒光定量PCR及Western blot等技術檢測了芹菜素對SALL4及Wnt通路下游因子c-Myc、CCND1表達的影響，發(fā)現(xiàn)芹菜素能下調(diào)SALL4、c-Myc、CCND1的表達，且 SALL4與 c-Myc、CCND1有明顯相關性，提示芹菜素可能通過抑制SALL4表達，阻斷Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮其抗白血病作用。

綜上所述，芹菜素對U937細胞有抑制增殖、誘導凋亡的作用。其機制可能與抑制SALL4基因的表達，阻斷Wnt/β-catenin信號通路，調(diào)控凋亡相關蛋白Bcl-2、Caspase-3的表達有關。

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