Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)效應(yīng)面法優(yōu)選長(zhǎng)葉胡頹子總黃酮提取工藝研究

楊代竹，李玉山

(1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院，湖北恩施445000;2.湖北民族學(xué)院 湖北 恩施 445000)

長(zhǎng)葉胡頹子(Elaeagnus bockii Diels)是胡頹子科胡頹子屬的一種，其資源豐富，主要分布在長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)[1]，其根莖或根、葉、果實(shí)均可供藥用或食用，是極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的中草藥[2]，主要用于治療支氣管哮喘、感冒咳嗽、腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿痛、腹瀉、痢疾、跌打、瘀積、肺病等[1，3，4]?；瘜W(xué)成分以黃酮類(lèi)為最多，此外還有三萜類(lèi)、甾體類(lèi)、蒽醌類(lèi)等化合物[5]。黃酮類(lèi)化合物具有抗炎、抗癌、抗輻射、提高機(jī)體免疫力、解熱鎮(zhèn)痛以及保肝護(hù)肝等作用[6]。目前尚未見(jiàn)有關(guān)長(zhǎng)葉胡頹子果實(shí)總黃酮的提取工藝研究報(bào)道，本研究利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)單因素篩選主要影響因素，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法描繪效應(yīng)對(duì)因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)效應(yīng)面法采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，較常用的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)精度高、預(yù)測(cè)性好、可信度高[7]。

1 儀器與試藥

粉碎機(jī)(鄭州華通機(jī)械廠)，UV1100紫外分光光度計(jì)(杭州科博儀器有限公司)，BS124S型電子天平(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-201(瑞士布奇公司)，循環(huán)水式多用真空泵SHB-III(鄭州長(zhǎng)城科技工貿(mào)有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京沃環(huán)科技實(shí)業(yè)有限公司)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100079-201005)，硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、三氯化鋁、95%的乙醇、石油醚均為分析純?cè)噭陨显噭┚?gòu)自成都科龍?jiān)噭S。實(shí)驗(yàn)用長(zhǎng)葉胡頹子藥材采自湖北恩施州巴東縣野三關(guān)，經(jīng)湖北民族學(xué)院李玉山鑒定為胡頹子科胡頹子屬長(zhǎng)葉胡頹子(Elaeagnus bockii Diels)果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 長(zhǎng)葉胡頹子果實(shí)脫脂處理

黃酮主要富集于植物組織細(xì)胞壁附近和蠟質(zhì)中，石油醚的浸提破壞了蠟質(zhì)層，有利于黃酮的釋放和提取[8]。石油醚能除去長(zhǎng)葉胡頹子大部分脂溶性雜質(zhì)，降低其對(duì)黃酮浸提的干擾。稱取一定量的長(zhǎng)葉胡頹子果實(shí)粉末，10倍量石油醚(60～90℃)浸漬一夜，回流脫脂2次，1h/次，濾過(guò)，濾渣揮干溶劑即得供試藥材粉末，晾干、備用。

2.2 供試品制備

稱取脫脂處理后的長(zhǎng)葉胡頹子粗粉(過(guò)20目篩)10g，精密稱定，加入95%乙醇200mL，70℃加熱回流2h，放冷，過(guò)濾，殘?jiān)性偌尤?5%乙醇200mL，回流提取2h，放冷，過(guò)濾，藥渣用少量95%乙醇沖洗，合并濾液，揮去溶劑定容至25mL量瓶中，加95%乙醇定容，即得供試品溶液。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別精密量取蘆丁對(duì)照品溶液與供試品溶液1mL，加入10mL 1%A1Cl3甲醇液，加甲醇定容，于室溫下顯色10min后，在200～800nm掃描。蘆丁對(duì)照品溶液在432nm有最大吸收，供試品溶液在417nm有最大吸收，選擇417nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁對(duì)照品適量，用甲醇溶解配制成濃度0.6mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別取黃酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液 0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5mL 置于 10mL 容量瓶中，加入 5mL1%A1Cl3甲醇液，加甲醇定容，于室溫下顯色10min后，以相應(yīng)試劑為空白，在417nm測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液濃度對(duì)吸光度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為:Y=0.329X+0.189，R=0.9994，線性范圍:0.0301～0.1504mg·mL-1。

2.5 含量測(cè)定

稱取10g干燥長(zhǎng)葉胡頹子粉末，按照供試品制備方法提取。移取lmL供試品溶液，加甲醇定容至10mL，以甲醇作空白，于417nm處測(cè)吸光度。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算長(zhǎng)葉胡頹子總黃酮含量。

2.6 提取工藝研究

選取乙醇濃度、浸泡時(shí)間、料液比、回流時(shí)間、回流溫度及回流次數(shù)6個(gè)可能影響提取效果的因素做單因素試驗(yàn)。以總黃酮得率為考察指標(biāo)，確定各因素變化陡峭的趨勢(shì)節(jié)點(diǎn)。

2.6.1 乙醇濃度考察 精密稱取5份粉末各10g，料液比為1∶10的不同濃度乙醇在回流溫度70℃時(shí)回流提取1次、60min/次，分別考察乙醇濃度60%、70%、80%、90%、95%對(duì)總黃酮含量影響，繪制黃酮得率與乙醇濃度關(guān)系曲線，結(jié)果顯示乙醇濃度在70%～95%范圍時(shí)，曲線變化陡峭。

2.6.2 料液比考察 精密稱取5份粉末各10g，95%乙醇濃度在回流溫度70℃時(shí)回流提取1次、60min/次，分別考察料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，對(duì)總黃酮得率影響，繪制黃酮得率與料液比關(guān)系曲線，結(jié)果顯示料液比為1∶10～1∶20時(shí)，曲線變化陡峭。

2.6.3 回流時(shí)間考察 精密稱取5份粉末各10g，料液比為1∶10的95%乙醇濃度在回流溫度70℃時(shí)提取1次，分別考察回流時(shí)間20、30、50、70、90min，對(duì)總黃酮含量影響，繪制黃酮含量與回流時(shí)間關(guān)系曲線，結(jié)果顯示回流時(shí)間為30～70min時(shí)，曲線變化陡峭。

2.6.4 浸泡時(shí)間考察 精密稱取5份粉末各10g，料液比為1∶10的95%乙醇在回流溫度70℃時(shí)回流1次，30min/次，分別在提取之前浸泡 0、2、4、6、8h，考察其對(duì)總黃酮含量影響，繪制黃酮含量與浸泡時(shí)間關(guān)系曲線，結(jié)果顯示浸泡時(shí)間為2～6h時(shí)，曲線變化陡峭。

2.6.5 回流溫度 精密稱取5份粉末約10g，料液比為1∶10的95%乙醇濃度回流提取1次，30min/次，考察回流溫度分別為 50、60、70、80、90℃時(shí)，對(duì)總黃酮含量影響，繪制黃酮含量與回流溫度關(guān)系曲線，結(jié)果顯示溫度為60～80℃時(shí)，曲線變化陡峭。

2.6.6 回流次數(shù)考察 精密稱取5份粉末各10g，料液比為1∶10的95%乙醇濃度為在溫度為70℃時(shí)，回流時(shí)間為30min/次，考察次數(shù)分別為 1、2、3、4、5 次時(shí)黃酮含量與回流次數(shù)關(guān)系曲線，結(jié)果顯示回流次數(shù)為1～3次時(shí)，曲線變化陡峭。

2.6.7 結(jié)論 通過(guò)單因素考察，確定各影響因素的實(shí)驗(yàn)范圍，乙醇濃度:80%～95%，料液比:1∶10～1∶20，回流時(shí)間:30～70min，浸泡時(shí)間:2～6h，回流溫度:60～80℃，回流次數(shù):1～3次。

2.6.8 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選主要影響因素①因素及水平范圍:根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取6個(gè)實(shí)驗(yàn)因素(A.乙醇濃度，B.料液比，C.回流時(shí)間，D.浸泡時(shí)間，E.回流溫度，F(xiàn).回流次數(shù))5 個(gè)空白因素(G、H、I、J、K)，合計(jì)12次實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素結(jié)果確定每個(gè)因素高、低2個(gè)水平。用Design expert 8.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。②P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果6個(gè)因素與5個(gè)空白因素合計(jì)12次實(shí)驗(yàn)，按照P-B設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)重復(fù)3次，計(jì)算總黃酮含量平均值。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表2，運(yùn)用Design expert 8.0軟件對(duì)各因素進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示P＜0.05的因素為主要影響因素。各因素顯著性分析結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)論:對(duì)各因素的顯著性分析可以看出，各因素對(duì)響應(yīng)值(總黃酮含量)影響的顯著性順序?yàn)?A＞B＞E＞D＞C＞F。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因子的水平范圍

表2 各因素顯著性檢驗(yàn)

2.6.9 星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)優(yōu)選工藝 ①星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)因素、水平及結(jié)果:根據(jù)Plackett-Burman篩選結(jié)果，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)效應(yīng)面法適用條件，選定三個(gè)主要因素即:A(乙醇濃度):70%～95%，B(料液比):1∶10～1∶20，E(回流溫度):60～80℃，Y(總黃酮含量)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝條件。星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表3，星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4。②回歸分析及結(jié)論:通過(guò)對(duì)擬合模型的優(yōu)化，剔除不顯著因素，對(duì)原方程二次回歸擬合，經(jīng)方差分析結(jié)果顯示 Pr＞F，此模型顯著(P=0.0052 ＜0.05)，B(料液比)及A2影響顯著，其它因素影響不顯著，其R-Squared=0.9014表明90.14%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異可以用此回歸模型來(lái)解釋?zhuān)瑢?shí)驗(yàn)過(guò)程中存在一定誤差，大約有9.86%不能由此模型解釋。"Lack of Fit F-value"of 0.47表明模型失擬不顯著。因此回歸方程:Y=1.52 －0.15A+0.40B －0.13C －0.17AC －0.37A2－0.12B2。根據(jù)回歸分析結(jié)果，圖1－圖4直觀反映了各因素對(duì)響應(yīng)值總黃酮含量的影響，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度和回流溫度交互影響對(duì)黃酮影響顯著，曲面變化顯著。運(yùn)用Design expert 8.0軟件響應(yīng)面分析，優(yōu)化最優(yōu)值為:料液比為1∶18的83%乙醇在64℃回流2次，30min/次時(shí)，其總黃酮含量預(yù)測(cè)值為1.93%。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.6.10 實(shí)驗(yàn)復(fù)證 稱取10g藥材，按照優(yōu)選工藝參數(shù)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化(乙醇濃度80%～85%，料液比為1∶15～1∶20，回流溫度60～65℃，回流2次，30min/次共進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，取其平均值，計(jì)算偏差率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖1 AC對(duì)響應(yīng)值Y影響三維曲面

圖2 A對(duì)響應(yīng)值Y影響三維曲面

圖3 B對(duì)響應(yīng)值Y影響三維曲面

圖4 C對(duì)響應(yīng)值Y影響三維曲面

表5 實(shí)驗(yàn)復(fù)證結(jié)果

3 結(jié)論

目前尚未見(jiàn)運(yùn)用此法優(yōu)選長(zhǎng)葉胡頹子黃酮類(lèi)成分的提取工藝研究報(bào)道，效應(yīng)面法是基于非線性模型設(shè)計(jì)的工藝設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)精度高。此工藝設(shè)計(jì)是基于優(yōu)選因素主效應(yīng)而進(jìn)行的多因素、高低兩個(gè)水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不僅可以提高實(shí)驗(yàn)精度而且還可以提高實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)性[9]。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選工藝參數(shù)經(jīng)過(guò)6次重復(fù)試驗(yàn)，其工藝參數(shù)在合適范圍內(nèi)波動(dòng)，其總黃酮含量變化不大，提示此工藝條件可以作為工業(yè)生產(chǎn)參考條件，具有可操作性。

根據(jù)目前有關(guān)長(zhǎng)葉胡頹子黃酮類(lèi)成分累計(jì)規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)藥材采集于2012年10月，主要是考慮黃酮類(lèi)成分此時(shí)含量較多[10]。筆者考察了超聲提取、回流提取兩種提取方法，結(jié)果顯示后者提取效果好.由于黃酮在紫外有兩個(gè)吸收區(qū)，存在較多干擾，因此，為了提高實(shí)驗(yàn)精度，本實(shí)驗(yàn)考察了A1Cl3和NaNO2-Al(NO3)3比色法，結(jié)果顯示前者蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)相差在5nm以內(nèi)，而后者蘆丁對(duì)照品在450nm左右有最大吸收，而供試品在此波長(zhǎng)范圍為吸收很弱，因此確定顯色方法為A1Cl3。

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