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    大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血研究非諾貝特納米混懸劑的體內(nèi)吸收

    2014-11-02 10:26:38王永祿呂貝貝高天嬰李學明南京工業(yè)大學藥學院南京211816
    西北藥學雜志 2014年4期
    關(guān)鍵詞:諾貝非諾貝特

    王 棟,王永祿,葉 雯,呂貝貝,韓 杰,高天嬰,李學明(南京工業(yè)大學藥學院,南京 211816)

    非諾貝特(fenofibrate)為第三代氯貝丁酯類降血脂藥物,經(jīng)口服吸收后,被體內(nèi)脂酶水解后變成活性產(chǎn)物非諾貝酸而起效[1],是臨床上常用的降脂調(diào)脂藥物之一。非諾貝特在水中幾乎不溶,所以口服吸收差,生 物 利 用 度 低[2]。 納 米 混 懸 劑 (nanosuspensions)是適用于難溶性藥物的新劑型,系將藥物顆粒粉碎到納米級后懸浮于分散介質(zhì)中,從而增加藥物的溶出速率,提高生物利用度[3]。本實驗采用大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血的方法,更真實地模擬了正常的生理條件,研究了非諾貝特納米混懸劑的在體腸吸收情況,并根據(jù)藥時曲線計算其藥動學參數(shù),以求更全面深入地揭示非諾貝特納米混懸劑在體內(nèi)的腸吸收過程。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器 高效液相色譜儀(日本島津制作所,LC-20AT、SPD-20A);紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司,TU-1901型);恒流蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司,BT00-300M型);電子分析天平(德國賽多利斯股份公司,BP211D型);數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司,HH-4型);醫(yī)用低速離心機(金壇市正基儀器有限公司,80-2型);微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠,WH-2型);高壓均質(zhì)機(意大利 GEA Niro Soavi公司,NS1001L2K);納米粒度分析儀(英國 Malvern儀器有限公司,3000HS);高剪切乳化器(上海弗魯克流體機械制造有限公司);恒溫磁力攪拌器(金壇市精達儀器制造廠)。

    1.2 試藥 非諾貝特原料藥及對照品、非諾貝酸對照品均由徐州恩華藥業(yè)公司提供;非諾貝特納米混懸劑為自制,批號20110820;氯貝酸由上海安譜科學儀器有限公司提供,批號C11480000;泊洛沙姆188由南京威爾化工有限公司提供;PVP K30購自上?;瘜W試劑公司;吐溫80購自上海凌峰化學試劑有限公司;酚紅購自南京奧多福尼生物科技有限公司;其余化學試劑均為分析純;三蒸水為自制。

    1.3 動物 SD大鼠,雄性,體質(zhì)量為250g左右,共6只。動物許可證號:SCXK(滬)2011-2010。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 非諾貝特納米混懸劑的制備 將PVP K30和泊洛沙姆188溶于三蒸水中,加入非諾貝特適量,于85℃水浴中加熱至熔融狀態(tài),再用高剪切乳化器以10 000r·min-1轉(zhuǎn)速乳化3min,置于高壓均質(zhì)機中,以300和500bar循環(huán)3次,再以800bar循環(huán)12次,將得到的樣品置于冰浴中,迅速冷卻固化,即得到非諾貝特納米混懸劑[4]。

    2.2 腸循環(huán)液中酚紅、非諾貝特及非諾貝酸的含量測定方法的建立

    2.2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(150mm×4.6mm,5μm);預柱:DIKMA(C18,10mm×4.6mm);流動相:甲醇-水(80∶20),用磷酸調(diào)pH 至3.0;柱溫:25℃;檢測波長:286nm;流速:1.0mL·min-1;進樣量:20μL[5]。

    2.2.2 溶液的配制 (1)Krebs-Ringer試液(pH 7.4,簡稱K-R試液)稱取氯化鈉7.8g、氯化鉀0.35g、無水氯化鎂0.02g、無水氯化鈣0.37g、磷酸二氫鈉0.32g、碳酸氫鈉1.37g、葡萄糖1.4g,加三蒸水溶解并稀釋至1L,即得。

    (2)非諾貝特對照溶液 取非諾貝特對照品50mg,精密稱定,置于100mL量瓶中,加無水乙醇溶解稀釋至刻度,作為儲備液;精密移取儲備液20mL,置于100mL量瓶中,加0.1g·mL-1的吐溫80溶液5mL,用K-R試液稀釋至刻度。

    (3)非諾貝酸對照溶液 取非諾貝酸對照品10mg,精密稱定,置于100mL量瓶中,用K-R試液溶解并稀釋至刻度,作為儲備液;精密量取5mL,置于50mL量瓶中,加K-R試液稀釋至刻度。

    (4)混合對照液 精密量取非諾貝特儲備液50mL、非諾貝酸儲備液10mL,置于100mL量瓶中,精密加入0.1g·mL-1的吐溫80溶液5mL,用K-R試液稀釋刻度。

    (5)空白腸循環(huán)液 取酚紅30mg,精密稱定,再稱取2.2.1中各物質(zhì),加乙醇50mL及0.1g·mL-1的吐溫80溶液50mL,用三蒸水溶解并稀釋至1L。將配制好的溶液在體循環(huán)4h,中止實驗,即得空白腸循環(huán)液。

    (6)腸循環(huán)供試液 精密量取非諾貝特納米混懸液適量,用空白腸循環(huán)液稀釋至含非諾貝特約100μg·mL-1的溶液,在體循環(huán)4h后中止,即得腸循環(huán)供試液。

    2.2.3 酚紅標準曲線的制備 取酚紅10mg,精密稱定,置于100mL量瓶中,用K-R試液溶解并稀釋至刻度,作為儲備液。精密移取酚紅儲備液0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35和0.4mL,置于10mL 量瓶中,用0.01mol·L-1氫氧化鈉溶液稀釋至刻度,作為標準工作溶液。取上述標準工作溶液,以0.01mol·L-1氫氧化鈉溶液為空白,于558nm測定吸光度,以吸光度A為縱坐標、酚紅質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)為橫坐標進行線性回歸,回歸方程:A=0.197 9C+0.003 9,r=0.999 3(n=5)。

    2.2.4 非諾貝特及非諾貝酸含量測定方法 取供試溶液5mL,以10 000r·min-1離心5min,取上清液1mL,置于10mL量瓶中,加0.01mol·L-1氫氧化鈉溶液稀釋至刻度,作為待測溶液,以0.01mol·L-1氫氧化鈉溶液為空白,于558nm測定吸光度,根據(jù)外標法計算酚紅質(zhì)量濃度。另取適量上清液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后,在2.2.1條件下進樣測定,記錄色譜圖,按外標法計算腸循環(huán)液中非諾貝特和非諾貝酸的質(zhì)量濃度。

    2.2.5 方法專屬性 分別取2.2.2項下(1)~(6)溶液,在2.2.1條件下注入液相色譜儀,記錄色譜圖,如圖1。結(jié)果顯示,腸循環(huán)樣品液中非諾貝酸、非諾貝特的保留時間與對照品的一致,分別為5.3和12.8min。其他成分在色譜條件下不干擾測定。

    圖1 非諾貝特、非諾貝酸HPLC測定色譜圖A.陰性對照液;B.非諾貝特對照液;C.非諾貝酸對照液;D.混合對照液;E.空白腸循環(huán)液;F.腸循環(huán)樣品液;1.非諾貝酸;2.非諾貝特Fig.1 HPLC chromatograms for fenofibrate and fenofibric acidA.negative sample;B.fenofibrate reference solution;C.fenofibric acid reference solution;D.reference solution with fenofibrate and fenofibric acid;E.blank circumfusion solution;F.circumfusion solution;1.fenofibric acid;2.fenofibrate

    2.2.6 線性 分別精密量取混合對照液0.01,0.1,0.5,2.5和5mL,置于10mL量瓶中,分別用 K-R試液稀釋至刻度,作為標準工作溶液。取上述標準工作溶液,在2.2.1條件下進樣,以色譜峰面積A為縱坐標、溶液質(zhì)量濃度C為橫坐標進行線性回歸。結(jié)果顯示,非諾貝特的回歸方程為:A=63 218C-2 844,r=0.999(n=5),線性范圍為0.25~124.68μg·mL-1;非諾貝酸的回歸方程為:A=90 819C-501.25,r=0.999 9(n=5),線性范圍為0.01~5.05μg·mL-1;表明二者線性均良好。

    2.2.7 最低檢測限考察 分別取非諾貝特對照液、非諾貝酸對照溶液逐步稀釋,進樣測定,以信噪比約為3∶1作為檢測限,得非諾貝特及非諾貝酸的最低檢測質(zhì)量濃度分別為10.0和1.01ng·mL-1。

    2.2.8 精密度 取2.2.6項下非諾貝特質(zhì)量濃度為0.25,12.47和124.68μg·mL-1的3份混合溶液,在2.2.1條件下分別連續(xù)進樣5次,記錄色譜圖,結(jié)果3種質(zhì)量濃度下非諾貝特峰面積RSD分別為0.31%,0.05%和0.03%,非諾貝酸峰面積 RSD分別為0.84%,0.15%和0.04%。另取上述溶液置于冰箱中保存,分別在1,2,3,4和5d取樣測定,記錄色譜圖,結(jié)果3種質(zhì)量濃度下非諾貝特峰面積RSD分別為0.99%,0.16%和0.10%,非諾貝酸峰面積RSD分別為2.13%,0.33%和0.12%。實驗結(jié)果表明方法日內(nèi)和日間精密度均良好。

    2.2.9 回收率 取混合對照品溶液1,2和3mL,分別置于10mL量瓶中,用K-R試液稀釋至刻度,作為不同質(zhì)量濃度的供試溶液。在2.2.1項條件下進行測定,記錄色譜圖,分別計算非諾貝特與非諾貝酸的回收率。結(jié)果如表1所示,結(jié)果表明方法回收率良好。

    2.2.10 穩(wěn)定性考察 將混合對照液置于37℃水浴中,放置4h后取出,用K-R試液稀釋后在2.2.1項條件下測定,比較放置前后藥物含量變化,結(jié)果放置后非諾貝特含量為放置前的98.24%,非諾貝酸含量為放置前的99.97%。實驗結(jié)果表明在K-R試液中2種物質(zhì)的穩(wěn)定性均良好。

    2.3 血漿藥物質(zhì)量濃度測定方法的建立

    2.3.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(150mm×4.6mm,5μm);預柱:DIKMA(C18,10mm×4.6mm);流動相:甲醇-水(75∶25),磷酸調(diào)pH 至3.0;柱溫:25℃;檢測波長:286nm;流速:1.0mL·min-1;進樣量:50μL。

    2.3.2 血漿樣品測定方法 取血漿樣品100μL,置于1.5mL離心管中,加內(nèi)標溶液50μL(100μg·mL-1的氯貝酸甲醇溶液),渦旋30s,再加入200μL蛋白沉淀劑(乙腈與1mol·L-1鹽酸以95∶5配制而成),渦旋30s,再以12 000r·min-1轉(zhuǎn)速離心處理15min,取上清液作為供試溶液,照2.3.1項下色譜條件測定。

    2.3.3 方法專屬性 分別配制空白血漿、空白血漿加內(nèi)標、空白血漿加非諾貝酸以及大鼠體內(nèi)給藥后血樣的供試溶液,在2.3.1條件下檢測,結(jié)果如圖2所示。

    表1 回收率實驗結(jié)果Tab.1 The result of recovery test

    圖2 方法專屬性驗證液相色譜圖A.空白血漿;B.內(nèi)標;C.非諾貝酸;D.動物給藥血樣Fig.2 HPLC chromatograms of plasma to verify the method specificityA.plasma blank;B.the internal standard;C.fenofibric acid;D.blood sample

    由圖2可見,內(nèi)標(氯貝酸)的保留時間約為4.9min,非諾貝酸的保留時間約為8.5min。色譜峰峰形良好,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾非諾貝酸的含量測定。

    2.3.4 線性 取非諾貝酸對照品適量,精密稱定,用甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度約為20和200μg·mL-1的儲備液 A 和 B,分別移取儲備液 A 0.2,0.4,1和2mL,儲備液B 0.4,1,1.5和2mL,置于10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度;分別取上述溶液50μL,用氮氣吹干后加入空白血漿樣品100μL,渦旋30s,照2.3.2處理得到血藥質(zhì)量濃度分別為0.2,0.4,1,2,4,10,15和20μg·mL-1的標準溶液;取上述溶液,在2.3.1條件下進行測定,記錄色譜圖,以非諾貝酸峰面積Ai與內(nèi)標峰峰面積As之比Ai/As對血漿非諾貝酸質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)進行線性回歸,得回歸方程:A=0.210 5C+0.027 8,r=0.999 9(n=8),表明非諾貝酸血藥質(zhì)量濃度與峰面積在2~80μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

    2.3.5 最低檢測質(zhì)量濃度 精密移取空白血漿100μL,向其中加入不同質(zhì)量濃度非諾貝酸對照溶液,照2.3.2進行處理并測定,以信噪比約為3作為檢測限,結(jié)果表明最低檢測限為200ng·mL-1。

    2.3.6 精密度 日內(nèi)精密度 按2.3.2項下方法平行制備5份質(zhì)量濃度為0.4,4和15μg·mL-1的樣品溶液,并于同日測定,記錄色譜圖。結(jié)果顯示3個質(zhì)量濃度下血漿中非諾貝酸RSD值分別為6.41%,1.1%和0.16%,表明其日內(nèi)精密度良好。

    日間精密度 取日內(nèi)精密度項下供試溶液,分別在1,2,3,4和5d取樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果顯示,5d內(nèi)非諾貝酸的RSD分別為4.65%,1.12%和0.2%,其日間精密度良好。

    2.3.7 凍融穩(wěn)定性實驗 取2.3.4項下質(zhì)量濃度為0.4,4和15μg·mL-1的樣品溶液,置于-80℃冰箱冷藏1周,取出,用37℃水浴解凍后,測定其血藥質(zhì)量濃度,并將結(jié)果與室溫放置的樣品進行比較。結(jié)果見表2。由表2可知,在室溫下以及在冰箱內(nèi)冷凍保存后再復融的3種質(zhì)量濃度的非諾貝酸血漿樣品測定值RSD均小于5%,表明在冷凍條件下,大鼠待測血漿樣品較為穩(wěn)定,因此,待測血漿樣品在冷凍條件下保存1周不會影響實驗測定結(jié)果的準確性。

    表2 凍融過程對含量測定的影響Tab.2 Stability of plasma samples in freezing conditions(n=3)

    2.4 大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血實驗

    2.4.1 實驗方法 實驗前大鼠禁食24h,稱體質(zhì)量后,于腹腔注射烏拉坦溶液(0.01mL·g-1)麻醉固定,在頸動脈處做好取血準備。沿腹中線打開腹腔(切口約2.5cm長),找出并結(jié)扎膽管,于實驗腸段兩端各切一小口,在切口處分別插入玻璃管并扎緊。用注射器從上切口處緩緩注入37℃的生理鹽水清洗腸管至凈。再將腸管兩端的玻璃管與蠕動泵連接形成回路。用蠕動泵將供試液以5mL·min-1流速循環(huán)10min后,調(diào)節(jié)流速為2.5mL·min-1,并立即自供試液錐形瓶中取樣5mL,作為測定零時刻腸循環(huán)液樣品,并向錐形瓶中補加酚紅液5mL。同時,從大鼠頸動脈取血1mL,置于肝素化刻度離心管中,其后每隔30min亦按同法取腸循環(huán)液(補加酚紅KR液)和血樣,循環(huán)4h后,中止實驗。腸循環(huán)樣品照2.2.4進行測定,結(jié)果以酚紅為參比進行校正,血樣照2.3.2方法處理后測定。實驗結(jié)果如表3所示。

    由表3數(shù)據(jù)可知,隨著腸腔中藥物含量的逐漸減少,血中藥物質(zhì)量濃度逐漸升高,從而印證了體外循環(huán)液中藥物的消失是因為吸收入血的結(jié)果。

    表3 大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血中腸內(nèi)藥物減少量及血藥質(zhì)量濃度Tab.3 The reductions in the intestine and the concentration in plasma of fenofibrate

    2.4.2 大鼠腸腔內(nèi)藥物減少量與血藥質(zhì)量濃度的相關(guān)性 以大鼠在體腸循環(huán)結(jié)合頸動脈取血實驗中的腸腔內(nèi)藥物累計減少量為自變量(x)、血藥質(zhì)量濃度為因變量(y),進行線性回歸,線性方程:y=7×10-5x

    +0.521 9,r=0.993 6。

    3 討論

    3.1 血漿藥物濃度檢測方法 本實驗參照有關(guān)文獻建立了大鼠血漿中非諾貝特降解活性代謝物非諾貝酸的HPLC檢測方法,血漿中內(nèi)源物質(zhì)不干擾非諾貝酸的含量測定,方法簡單快捷,專屬性強。大鼠血漿中藥物線性關(guān)系良好(r=0.997 5,n=8),準確度在90%~110%之間,日間和日內(nèi)精密度小于10%,最低檢測限為100ng·mL-1,凍融實驗符合要求,該方法能夠滿足血漿樣品中非諾貝酸的測定要求。

    3.2 動物體內(nèi)吸收的研究方法 本課題中所采用的動物實驗方法為改良的腸襻法,傳統(tǒng)的腸襻法是將大鼠的腸腔結(jié)扎,有時需要做部位研究時,也可以分段結(jié)扎腸腔。將藥物溶液注入到腸襻中,經(jīng)過一定時間的吸收后,取出腸襻,收集沖洗腸腔內(nèi)腸液,測定剩余的藥物量[6]。根據(jù)藥物的減少量來了解藥物在腸腔的吸收情況。腸襻法可以考察藥物的吸收情況和部位差異,以及促進劑的促吸收效果,在實驗過程中避免破壞血液供應和淋巴流。

    在體腸循環(huán)法雖然與正常的生理條件最為接近,但是實驗手術(shù)對大鼠生理特征的改變必定會影響正常的藥物體內(nèi)行為。此外,在操作過程中,麻醉、背位固定的方式及連續(xù)取血等操作也經(jīng)常會加速大鼠的死亡,影響血樣的正常采集和數(shù)據(jù)的完整。

    鑒于體內(nèi)血藥質(zhì)量濃度測定與在體腸灌注法研究藥物體內(nèi)吸收均存在各自的優(yōu)缺點,本課題采用兩種方法相結(jié)合的方式,同時研究非諾貝特納米混懸劑在大鼠體內(nèi)的腸吸收與體內(nèi)藥動學過程,以求更全面深入地揭示非諾貝特納米混懸劑的體內(nèi)吸收過程。實驗結(jié)果表明,大鼠在體腸循環(huán)實驗與動物整體的藥物吸收程度有較好的相關(guān)性,血藥質(zhì)量濃度與腸腔中藥物減少量在相應的各個時間點分別相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.993 6,可以判定兩者為點對點相關(guān),相關(guān)水平最高,此時腸吸收藥量可以直接反映藥物吸收入血的程度[7],提示在體腸循環(huán)模型可用于非諾貝特納米混懸劑的處方優(yōu)化,預測非諾貝特的體內(nèi)吸收情況。

    [1]Hanafy A,Spahn-Langguth H,Vergnault G,et al.Pharmacokinetic evaluation of oral fenofibrate nanosuspensions and SLN in comparison to conventional suspensions of micronized drug[J].Adv Drug Del Rev,2007,59(6):419-426.

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