廣西瑤藥雞爪風(fēng)提取物抑制4種人肝癌細胞株體外增殖作用的研究

羅 艷，焦 楊，邱 莉，方 芳，謝集照，謝 婷（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

廣西瑤藥雞爪風(fēng)（Desmos chinensis Lour.）為番荔枝科（Annonaceae）假鷹爪屬（Desmos Lour.）植物，又名碎骨王、雞香木、雞爪木、假鷹爪、酒餅藤。雞爪風(fēng)作為民間習(xí)用藥材具有悠久歷史，最早記載于《嶺南采藥錄》，其味辛，性溫，有小毒，歸脾、肝經(jīng)；行氣消滯，祛風(fēng)止痛，殺蟲；用于治療消化不良、產(chǎn)后腹痛、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、瘧疾、水腫、魚骨梗喉、疥癬等［1－3］，在我國主要分布在廣東、廣西、云南和貴州等地［4］?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，雞爪風(fēng)所屬的假鷹爪屬植物具有抗腫瘤、抗艾滋病毒（HIV）、抗氧化、抗菌、強心、抑制芳香酶和脂肪氧化酶、抑制活化T細胞核因子（NFAT）轉(zhuǎn)錄等多種生物活性［5］。筆者研究雞爪風(fēng)提取物在體外對4種不同人肝癌細胞株增殖的影響，以期為進一步深入研究雞爪風(fēng)抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 FD－1D－50真空冷凍干燥器（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；1450型無菌超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備總廠）；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fischer）；MK3 型 酶 標 儀 （美 國 Thermo MULTISKAN公司）；CKX－41型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；TDL－5A型低速離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；AB204－N電子分析天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司）；DW86L621超低溫冰箱（海爾公司）。

1.2 試藥 RPMI1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號NYC0834）；DMEM 培養(yǎng)液（美國 Hyclone公司，批號NYD0844）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號130624）；MTT（北京Solarbio公司，批號0739）；質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶－EDTA（北京Solarbio公司，批號20130712）；DMSO（北京Solarbio公司，批號302A037）。雞爪風(fēng)，采自廣西梧州市岑溪縣，經(jīng)廣西食品藥品檢驗所韋家福主任中藥師鑒定為番荔枝科 （Annonaceae）假 鷹 爪 屬 （Desmos Lour.）雞 爪 風(fēng)（Desmos chinensis Lour.）的莖葉。藥材留樣編號為JZF20121010，現(xiàn)保存于廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室。

1.3 細胞株 肝癌 HCC－LM3、BEL－7404、SMMC－7721、HepG2細胞株，由廣西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實驗中心提供并傳代培養(yǎng)。

2 方法

2.1 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物的制備 10kg雞爪風(fēng)樣品，用10倍量體積分數(shù)85%乙醇滲漉提取3次，合并3次提取液，減壓濃縮，制成體積分數(shù)85%乙醇總提取物浸膏。提取物經(jīng)真空冷凍干燥，取適量提取物溶解于PBS緩沖液中，配成2mg·mL－1儲備液，濾膜（0.22μm）過濾，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng) 將BEL－7404、SMMC－7721、HepG2和HCC－LM3細胞于37℃、體積分數(shù)5%CO2的條件下培養(yǎng)，其中 BEL－7404、SMMC－7721、HepG2細胞使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，HCC－LM3細胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每天觀察細胞生長情況及細胞密度，并及時換液和傳代，維持細胞正常生長，保持良好的細胞狀態(tài)。

2.3 實驗分組 A組（藥物組）：雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物藥液，設(shè)置5個質(zhì)量濃度組，每個質(zhì)量濃度設(shè)3個平行孔。以質(zhì)量濃度為0.8，0.4，0.2，0.1和0.05mg·mL－1體積分數(shù)85%乙醇提取物分別對HCC－LM3、BEL－7404細胞作用24和48h。以質(zhì)量濃度為0.5，0.25，0.125，0.075和0.037 5mg·mL－1體積分數(shù)85%乙醇提取物分別對SMMC－7721、HepG2細胞作用24和48h。B組（不同質(zhì)量濃度的體積分數(shù)85%乙醇提取物本底值組）：本底值組，不加MTT，只加培養(yǎng)基和不同質(zhì)量濃度藥物，共5個質(zhì)量濃度組。C組：陰性對照組（不加藥物）。

2.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài) 按上述實驗分組實驗后，不同質(zhì)量濃度的雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取 物 分 別 作 用 HCC－LM3、BEL－7404 和 SMMC－7721、HepG2細胞24h，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)的改變。

2.5 MTT 法測定［6－8］取對數(shù)生長期的細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS液輕微洗滌細胞2～3次；用質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化后，將細胞吹打成單個細胞的細胞懸浮液，在倒置顯微鏡下用細胞計數(shù)板計算細胞數(shù)量。將細胞濃度調(diào)整為4×104～5×104個·mL－1，每孔加100μL細胞懸液，均勻地接種于96孔培養(yǎng)板中。將接種后的培養(yǎng)板移入CO2孵箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁生長。之后A組每孔加入100μL配制好的不同質(zhì)量濃度的藥液；B組每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基；C組為對照組，加入100μLPBS液。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24和48h后，加藥組A組和對照組C組每孔加入20μL 5g·L－1MTT溶液，本底值組B組不加MTT只加無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清，A組和C組每孔加入200μLDMSO，B組每孔加100μL不同質(zhì)量濃度藥物和100μLDMSO，15min內(nèi)于492nm波長處測定吸光度（A）值。計算細胞增殖抑制率。

2.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 15.0軟件進行分析統(tǒng)計，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，進行t檢驗和單因素方差分析，以P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對肝癌細胞形態(tài)的影響 藥物處理肝癌細胞24h后，倒置顯微鏡下觀察，對照組細胞生長較活躍，細胞貼壁生長，呈多邊形、異型性明顯。而加藥組細胞生長較緩慢，細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯的改變，細胞核固縮，細胞體積變小、變圓、有脫落，隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，細胞數(shù)量明顯減少，死亡細胞多見。見圖1。

圖1 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對肝癌細胞形態(tài)的影響Fig.1 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the morphologies of four human hepatoma cell lines

3.2 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對肝癌細胞增殖的影響 與陰性對照組相比較，結(jié)果見表1～表4。不同質(zhì)量濃度體積分數(shù)85%乙醇提取物處理HCC－LM3、BEL－7404、SMMC－7721和 HepG2肝癌細胞24和48h后，均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，作用隨質(zhì)量濃度的增加而增大；相同質(zhì)量濃度雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物處理上述4種肝癌細胞不同的時間時，其抑制作用隨用藥時間的延長而增強，呈時間和劑量－效應(yīng)依賴關(guān)系。

表1 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對HCC－LM3細胞增殖的影響Tab.1 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of HCC－LM3cell line（±s，n＝3）

表1 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對HCC－LM3細胞增殖的影響Tab.1 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of HCC－LM3cell line（±s，n＝3）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 質(zhì)量濃度／mg·mL－1 24h A 抑制率／%48h A 抑制率／%對照組 — 0.510±0.029 — 0.723±0.009—47.02藥物組 0.8 0.188±0.046＊＊ 63.14 0.008±0.010＊＊ 98.89 0.4 0.344±0.038＊＊ 32.55 0.118±0.013＊＊ 83.68 0.2 0.370±0.041＊＊ 27.45 0.251±0.018＊＊ 65.28 0.1 0.413±0.004＊＊ 19.02 0.367±0.027＊＊ 49.24 0.05 0.450±0.008＊ 11.76 0.383±0.015＊＊

表2 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對BEL－7404細胞增殖的影響Tab.2 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of BEL－7404cell line（±s，n＝3）

表2 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對BEL－7404細胞增殖的影響Tab.2 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of BEL－7404cell line（±s，n＝3）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 質(zhì)量濃度24h48h／mg·mL－1A 抑制率／%A 抑制率／%對照組 — 0.386±0.002 — 0.776±0.038—藥物組 0.8 0.100±0.014＊＊ 74.09 0.146±0.010＊＊ 81.19 10.31 0.4 0.278±0.001＊＊ 27.98 0.449±0.010＊＊ 42.14 0.2 0.347±0.047 10.10 0.597±0.005＊＊ 23.07 0.1 0.354±0.022 8.29 0.656±0.015＊＊ 15.46 0.05 0.376±0.027 2.59 0.696±0.033＊

表3 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對SMMC－7721細胞增殖的影響Tab.3 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of SMMC－7721cell line（±s，n＝3）

表3 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對SMMC－7721細胞增殖的影響Tab.3 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of SMMC－7721cell line（±s，n＝3）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 質(zhì)量濃度24h48h／mg·mL－1A 抑制率／%A 抑制率／%對照組 — 0.757±0.016 — 1.056±0.004—藥物組 0.5 0.352±0.005＊＊ 53.50 0.329±0.006＊＊ 68.84 11.55 0.25 0.612±0.017＊＊ 19.15 0.562±0.009＊＊ 46.78 0.125 0.666±0.032＊ 12.02 0.796±0.005＊＊ 24.62 0.075 0.729±0.014 3.70 0.894±0.009＊＊ 15.34 0.037 5 0.739±0.016 2.38 0.934±0.014＊＊

表4 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對HepG2細胞增殖的影響Tab.4 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of HepG2cell line（s，n＝3）

表4 雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對HepG2細胞增殖的影響Tab.4 The effect of the Desmos chinensis Lour.extract on the proliferation of HepG2cell line（s，n＝3）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 質(zhì)量濃度24h48h／mg·mL－1A 抑制率／%A 抑制率／%對照組 — 0.601±0.016 — 0.779±0.010—藥物組 0.5 0.350±0.009＊＊ 41.76 0.436±0.011＊＊ 44.03 13.35 0.25 0.455±0.016＊＊ 24.29 0.521±0.015＊＊ 33.12 0.125 0.521±0.001＊＊ 13.31 0.616±0.040＊ 20.92 0.075 0.565±0.011＊ 5.99 0.633±0.014＊＊ 18.74 0.037 5 0.605±0.019 — 0.675±0.028＊＊

4 討論

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，按來源將其分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌。其中原發(fā)性肝癌臨床上以肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為主，約占原發(fā)性肝癌的80%～90%［9］。多激酶抑制劑如索拉非尼、舒尼替尼在臨床上用于治療中晚期HCC［10］。目前，各種靶向酪氨酸激酶受體細胞信號通路的抑制劑或抗體是抗肝癌藥物的研究熱點，其中一些有潛力的候選藥物已經(jīng)進入到臨床試驗的階段［10］，從天然產(chǎn)物中尋找蛋白酪氨酸激酶抑制劑是發(fā)現(xiàn)抗肝癌新藥的一個重要途徑［11］，近年來文獻報道的天然產(chǎn)物中蛋白酪氨酸激酶抑制劑按其結(jié)構(gòu)類型包括酚類、醌類、生物堿、甾醇等。多酚類化合物黃酮類如牡荊素、桑色素、兒茶素和染料木素等具有多重抗腫瘤效應(yīng)，如：抑制細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制腫瘤侵襲等，但是，黃酮類化合物因來源不同、結(jié)構(gòu)不同，表現(xiàn)出的生物活性差異很大［12］。番荔枝科（Annonaceae）植物富含生物堿、萜類、黃酮、番荔素、多氧環(huán)己烯和苯乙烯內(nèi)酯等植物化學(xué)成分，其中的番荔素、多氧環(huán)己烯和苯乙烯內(nèi)酯等類型化合物具有極好的抗腫瘤活性，因此，對番荔枝科植物的化學(xué)成分研究是當前國內(nèi)外繼紅豆杉之后的又一抗腫瘤新藥研發(fā)熱點［13］。文獻報道，番荔枝科假鷹爪屬植物的某些植物化學(xué)成分在體外表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，如desmosdumotin C對多種腫瘤細胞，如HOS、MCF－7、IA9、HCT－8、KB、KB－VIN 等具有明顯的抑制作用［14］。desmosflavan A和desmosflavan B對癌細胞 HuCCA－1、HepG2、A549、MOLT－3等有細胞毒作用，其中desmosflavan A對癌細胞的抑制效果顯著，IC50分別為2.25，3.75，2.45和0.29μg·mL－1；desmosflavan B的IC50分別為22.0，20.3，27.0和1.71μg·mL－1［15］?；衔颿hinendihydrochalcone對癌細胞MOLT－3具有抑制活性（IC50為7.16μg·mL－1）［16］。

廣西瑤藥雞爪風(fēng)（Desmos chinensis Lour.）為番荔枝科（Annonaceae）假鷹爪屬（Desmos Lour.），本實驗采用體積分數(shù)85%乙醇滲漉提取其總成分，并選用4種不同人肝癌細胞株 HCC－LM3、BEL－7404、SMMC－7721、HepG2為研究對象，通過MTT比色法觀察雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物對上述細胞體外增殖的影響。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的雞爪風(fēng)體積分數(shù)85%乙醇提取物均可抑制人肝癌細胞HCCLM3、BEL－7404、SMMC－7721、HepG2增殖，在質(zhì)量濃度達到0.2mg·mL－1以上時，對人肝癌細胞HCC－LM3、BEL－7404、SMMC－7721、HepG2的增殖有較強的抑制作用，其體外增殖的抑制作用與其質(zhì)量濃度和作用時間相關(guān)，呈劑量與時間效應(yīng)依賴性，實驗結(jié)果表明，廣西瑤藥雞爪風(fēng)抗肝癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制值得深入研究。

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