HPLC法測定和血明目片中黃芩苷的含量

田 園，王海亮，解笑瑜，王嗣岑＊（.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 7006；.西安碑林藥業(yè)股份有限公司，西安70048）

和血明目片是由蒲黃、丹參、地黃、墨旱蓮、菊花、黃芩（炭）、決明子等19味中藥組成的復(fù)方制劑，具有涼血止血、滋陰化瘀、養(yǎng)肝明目等功效，用于陰虛肝旺，熱傷絡(luò)脈所引起的眼底出血［1］。黃芩為和血明目片的藥材之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，其中黃芩苷為黃芩的主要成分。目前，國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的和血明目片標(biāo)準(zhǔn)中僅有丹參素的含量測定，無黃芩苷的含量測定方法，故參考有關(guān)文獻(xiàn)［2－5］，建立反相高效液相色譜法測定和血明目片中黃芩苷的含量。經(jīng)方法學(xué)考察，該法具有簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于和血明目片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex UltiMate3000SD全自動(dòng)高效液相色譜儀，UltiMate 3000二極管陣列檢測器（美國戴安公司）；DenverTP214分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；Precisa ES225SM－DR（十萬分之一）天平（普利賽斯國際貿(mào)易（上海）有限公司）。

1.2 試藥 黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715－200815）購于中國食品藥品檢定研究院；和血明目片由西安碑林藥業(yè)股份有限公司提供（批號(hào)201310034，201310035，201310036）；乙醇為分析純（利安?。ㄌ旖颍┗す荆?；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：ODS Hypersil C18色譜柱（250mm ×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－水－磷酸（47∶53∶0.2）［6］；檢測波長：280nm；流速：1.0mL·min－1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10μL。在此條件下，黃芩苷與和血明目片中其他組分色譜峰基線分離且陰性樣品無干擾。表明該方法有較強(qiáng)的專屬性；理論板數(shù)不低于2 500。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備及最大吸收波長的選擇 配制一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，精密進(jìn)樣10μL，在波長范圍190～460nm內(nèi)掃描吸收光譜，結(jié)果在278.3nm處有最大吸收。參考《中國藥典》2010年版一部黃芩中黃芩苷的含量測定波長，選用280nm為檢測波長。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取和血明目片適量，除去包衣，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)50%甲醇25mL密塞，稱定質(zhì)量，搖勻，超聲處理10min（功率250W，頻率40kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖1 HPLC圖A.黃芩苷對(duì)照品；B.陰性對(duì)照；C.和血明目片；1.黃芩苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.baicalin reference；B.negative control；C.Hexuemingmu Tablets；1.baicalin

2.4 陰性樣品溶液的制備 取按處方比例及生產(chǎn)制備方法，制備不含黃芩的陰性樣品，按照2.3項(xiàng)下的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 取2.2項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇－水（1∶1）制備質(zhì)量濃度分別為0.026 2，0.065 6，0.131 2，0.262 4和0.393 6mg·mL－1的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）為自變量、峰面積（Y）為因變量，得回歸方程：Y＝26 234 X＋17.382，r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，在此色譜條件下，黃芩苷在0.026 2～0.393 6mg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液，在2.1色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.21%（n＝5），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一批供試品（批號(hào)201310034），分別于0，2，4，6，8，12和24h，按照2.1色譜條件測定黃芩苷不同時(shí)間的峰面積，RSD為1.23%，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（201310034）樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析。共測定6次，結(jié)果黃芩苷含量的平均值為2.965mg·片－1（n＝6），RSD為0.7%，表明重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量（黃芩苷含量為9.884mg·g－1）的和血明目片6份，每份約0.25g，分別精密加入黃芩苷對(duì)照品0.495 2mg·mL－1的溶液5mL，再精密加入體積分?jǐn)?shù)50%甲醇20mL。按上述確定的方法制成供試品溶液，測定樣品中的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果黃芩苷的平均回收率為96.3%，RSD為1.6% ，結(jié)果表明本法回收率良好。見表1。

表1 黃芩苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery of baicalin（n＝6）

2.10 樣品的測定 分別取3個(gè)批號(hào)的和血明目片，每批樣品取2份，在2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密進(jìn)樣10μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，測定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算黃芩苷的含量，測定結(jié)果3批樣品的平均含量分別為2.980 5，2.940 0和2.975 2mg·片－1。

3 討論

在供試品溶液的制備方法中，首先對(duì)提取溶媒進(jìn)行考察，分別用甲醇、乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取，結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取黃芩苷含量最高；對(duì)提取方式進(jìn)行考察，分別用超聲提取和回流提取，結(jié)果表明，超聲提取含量高且操作簡便；對(duì)超聲提取進(jìn)行考察，分別超聲5，10，20和30min，結(jié)果表明超聲10min即可提取完全。

在對(duì)流動(dòng)相考察中，分別用甲醇－水體系和乙腈－水體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，流動(dòng)相為甲醇－水－磷酸（47∶53∶0.2）時(shí)即可達(dá)到基線分離，且黃芩藥材陰性樣品無干擾［7］。

和血明目片生產(chǎn)工藝中，黃芩等藥材打粉入藥，丹參等藥材加水煎煮，藥粉同浸膏混合制粒壓片。目前執(zhí)行的藥品標(biāo)準(zhǔn)，僅對(duì)丹參素的含量進(jìn)行測定，即對(duì)提取工藝進(jìn)行控制，未對(duì)打粉工藝進(jìn)行含量控制，故建立黃芩苷的含量測定方法，可對(duì)打粉工藝進(jìn)行質(zhì)量控制。目前僅對(duì)3批和血明目片進(jìn)行了含量測定，數(shù)據(jù)較少，還需進(jìn)一步測定多批樣品，積累有關(guān)數(shù)據(jù)，擬定合理限度。

［1］王輝，高健生.和血明目片方義及臨床應(yīng)用［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（12）：17－18.

［2］呂士杰，李妍，蘆曉晶，等.HPLC測定芩丹顆粒中黃芩苷、梔子苷和丹皮酚［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（6）：81－84.

［3］陸祥，宋劍鋒.RP－HPLC法測定止血祛瘀明目片中黃芩苷含量［J］.浙江中醫(yī)雜志，2011，46（12）：921－922.

［4］陳珂，宋嵐，祁明，等.高效液相色譜法測定杏杷止咳顆粒中黃芩苷含量［J］.中國藥業(yè)，2011，20（1）：26－27.

［5］李玲玲，趙蘭芬.清開靈不同制劑中黃芩苷的含量測定［J］.藥物分析雜志，2011，31（5）：950－953.

［6］國家藥典委員會(huì).中國藥典2010年版［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：2831.

［7］薛磊冰，周燕，金佩芬.HPLC法測定婦炎康復(fù)片中黃芩苷和橙皮苷的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2010，25（6）：405－406.