復方山楂顆粒的質量標準研究

馬宏達，何 進，胡 北，王琳琳，史國兵（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽 110016）

復方山楂顆粒為沈陽軍區(qū)總醫(yī)院院內制劑，是由山楂和決明子組成的復方中藥制劑，具有散瘀消食的功效，臨床上用于治療高脂血癥。復方山楂顆粒中山楂為君藥，山楂為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥果實，具有消食健脾、行氣散瘀、化濁降脂［1］的功效，臨床上主要用于治療肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛，現(xiàn)代藥理學研究表明，山楂果實、山楂葉具有助消化、降壓、降脂等作用［2］。齊墩果酸和熊果酸是已確知的山楂三萜酸類代表性化學成分，二者結構相近且含量差別較大，故需進行分離測定以便更好地控制山楂制劑的質量。因此，本文采用高效液相色譜法對山楂中的齊墩果酸和熊果酸進行含量測定，并采用薄層色譜法對方中山楂進行定性鑒別，建立了該制劑的質量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（配備501型泵，486型紫外檢測器，美國Waters公司）；AUW 120D型電子分析天平（島津公司）；水浴鍋（金壇市雙捷實驗儀器廠）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 復方山楂顆粒（批號20130506，2013612，20130722）及各陰性樣品均由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院自制；齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為：110709－200505）；熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110742－200519）；水為重蒸水（自制）；甲醇（色譜純，天津四友生物技術有限公司）；乙腈（色譜純，購自Fisher公司）；乙酸銨（國藥集團化學試劑廠）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 山楂的薄層鑒別 取本品5g，加入甲醇50mL，加熱回流30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20mL使其溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解作為供試品溶液。另取山楂對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液。再取按處方比例制成的缺山楂的陰性樣品5g，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）實驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－環(huán)己烷－甲酸（10∶6∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Welchrom C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－乙腈－10mmol·L－1乙酸銨（55∶27∶18）［3］；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：215nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 取置于五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h以上的齊墩果酸和熊果酸對照品，精密稱定，加入適量甲醇使溶解，制成每1mL含40μg的熊果酸及10μg的齊墩果酸的混合溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品研細，稱取約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，密塞，超聲處理30min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得［4－5］。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取按處方除去山楂的陰性樣品0.5g，按2.2.3項下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.2.5 專屬性考察 分別精密吸取陰性對照溶液、供試品溶液、對照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，測定結果見圖1。

結果表明，齊墩果酸、熊果酸的保留時間分別約為37和39min，陰性對照樣品不干擾齊墩果酸、熊果酸的測定，齊墩果酸、熊果酸與其他成分或雜質的分離度大于1.5，理論板數(shù)按熊果酸峰計算應均不低于3 000。

2.2.6 線性關系考察 精密吸取質量濃度為2.5，5，10，20，40和80μg·mL－1的齊墩果酸和質量濃度為10，20，40，80，160和320μg·mL－1的熊果酸混合對照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按2.2.1色譜條件分析，測定各自峰面積，以對照品質量濃度（μg·mL－1）為橫坐標、峰面積值為縱坐標，求得齊墩果酸的回歸方程：y＝5 039.5x＋2 262.9，r＝0.999 6，結果表明，齊墩果酸的質量濃度在2.5～80μg·mL－1范圍內與峰面積呈良好的線性關系；熊果酸的回歸方程y＝5 250.6x－9 724.7，r＝0.999 7，結果表明，熊果酸的質量濃度在10～320μg·mL－1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

圖1 高效液相色譜圖A.齊墩果酸對照品和熊果酸對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.齊墩果酸；2.熊果酸Fig.1 HPLC chromatogramsA.oleanic acid reference and ursonic reference；B.test sample；C.negative control；1.oleanic acid；2.ursonic

2.2.7 精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液20μL，按2.2.1色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰的峰面積，測得齊墩果酸峰面積值的RSD＝1.15%（n＝6），熊果酸峰面積值的RSD＝1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，按2.2.1色譜條件分析，分別在0，2，4，6，8和10h測定各自樣品中齊墩果酸和熊果酸的峰面積，測得齊墩果酸峰面積值的RSD＝1.85%（n＝6），熊果酸峰面積值的RSD＝1.65%（n＝6），表明供試品溶液在10h內穩(wěn)定。

2.2.9 重復性實驗 取同一批樣品，研細，取約0.5g（共6份），精密稱定，按照2.2.3供試品溶液制備操作，按2.2.1色譜條件分析，測定每份樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量。結果樣品中齊墩果酸平均含量為1.036 9mg·g－1，RSD＝2.27%（n＝6），熊果酸平均含量為4.081 1mg·g－1，RSD＝1.78%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率實驗 取同一批樣品，研細，取約0.25g（共6份），精密稱定，分別加入齊墩果酸對照品溶液（0.9mg·mL－1）各1mL，熊果酸對照品溶液（0.25mg·mL－1）各1mL，稱定質量，再按照2.2.3供試品溶液制備操作，制成回收率用供試品溶液，按2.2.1色譜條件分析，測定樣品中含量，計算回收率，結果齊墩果酸平均回收率為98.4%，RSD＝2.1%（n＝6），熊果酸平均回收率為98.6%，RSD＝1.9%（n＝6），結果見表1。

表1 加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.11 樣品含量測定 取3批樣品各約0.5g，分別按照2.2.3供試品溶液制備操作，按2.2.1色譜條件進樣測定峰面積，以外標法計算3批樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量。結果3批樣品中齊墩果酸的含量分別為1.000 2，1.079 1和1.046 6mg·g－1；3批樣品中熊果酸的含量分別為3.889 4，4.113 7和4.024 8mg·g－1。

3 討論

本實驗考察了不同流動相對分離度的影響，如：甲醇－5mL·L－1磷酸水溶液（88∶12），甲醇－5mL·L－1磷酸水溶液（86∶14），甲醇－5mL·L－1醋酸水溶液（82∶18），乙腈－5mL·L－1磷酸水溶液（85∶15），甲醇－乙腈－10mmol·L－1醋酸銨（55∶27∶18），最終確定了最佳流動相為甲醇－乙腈－10mmol·L－1醋酸銨（55∶27∶18），分離度＞1.5，分離效果較好。

由于熊果酸和齊墩果酸均屬三萜酸，且結構極為相似，兩者極性幾乎無差別，因此在薄層板上很難將2種成分分離開，而這2種成分在天然植物中似乎又是共生共存的，因此，建立HPLC法對其進行含量測定就顯得尤為重要。本實驗采用HPLC法測定復方山楂顆粒中齊墩果酸和熊果酸的含量，方法簡便、可靠、準確，可用于復方山楂顆粒中齊墩果酸和熊果酸的質量控制。

［1］國家藥典委員會.中國藥典2010年版 ［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：29.

［2］王嫦鶴，張秉華，劉芳，等.HPLC法同時測定山楂中的山楂酸、齊墩果酸和熊果酸［J］.西北藥學雜志，2011，26（1）：35－37.

［3］石靜，聶晶，馮鈺锜，等.HPLC法測定女貞葉乙醇提取物中的齊墩果酸與熊果酸［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25（3）：210－214.

［4］白雪梅，付煜榮，田嘉銘.高效液相色譜法測定大山楂丸和山楂鮮果中齊墩果酸及熊果酸的含量［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2006，26（8）：981－982.

［5］崔洪泉，蔣秀芳.高效液相色譜法測定山楂藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量［J］.臨床合理用藥，2011，4（7）：109－110.